माइक्रोफ्लुइडिक्स-अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया का सहायक चयनात्मक विध्रुवण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया के सीडिंग और धुंधला होने का वर्णन करता है। इन कक्षों में द्रव दबाव ढाल कोशिका शरीर के डिब्बे को प्रभावित किए बिना औषधीय चुनौतियों के जवाब में उनके गुणों का विश्लेषण करने के लिए अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के चयनात्मक उपचार की अनुमति देता है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया न्यूरॉन्स में एटीपी (एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट) के प्राथमिक आपूर्तिकर्ता हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक सामान्य फेनोटाइप है। कुछ अक्षतंतु की विस्तृत वास्तुकला और अत्यधिक लंबाई को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया अपने सेल शरीर समकक्षों की तुलना में अलग-अलग वातावरण का अनुभव कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया की शिथिलता अक्सर कोशिका शरीर पर प्रभाव से पहले होती है। विट्रो में अक्षीय माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को मॉडल करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सोमल माइटोकॉन्ड्रिया को प्रभावित किए बिना अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया के उपचार की अनुमति देते हैं। इन कक्षों में द्रवीय दबाव ढाल ढाल के खिलाफ अणुओं के प्रसार को रोकता है, इस प्रकार अक्षतंतु के भीतर स्थानीय औषधीय चुनौतियों के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल गुणों के विश्लेषण की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में अलग-थलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के सीडिंग, झिल्ली-संभावित संवेदनशील डाई के साथ धुंधला, माइटोकॉन्ड्रियल विष के साथ उपचार और बाद के सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करता है। अक्षीय जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए यह बहुमुखी विधि कई औषधीय गड़बड़ी और इमेजिंग रीडआउट पर लागू की जा सकती है, और कई न्यूरोनल उपप्रकारों के लिए उपयुक्त है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया न्यूरॉन्स में एटीपी (एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट) के मुख्य आपूर्तिकर्ता हैं। चूंकि न्यूरोनल स्वास्थ्य माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि इन ऑर्गेनेल के बेकार विनियमन को पार्किंसंस रोग1 सहित विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की शुरुआत से जोड़ा गया है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल नशा जानवरों में पार्किंसनियन लक्षणों को मॉडल करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै। पशु मॉडल और मानव रोग दोनों में, न्यूरॉन्स का निधन डिस्टल भागों 3,4 से शुरू होता है, यह संकेत देते हुए कि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया अपमान के लिए अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। हालांकि, कोशिका शरीर प्रक्रियाओं की एक साथ गड़बड़ी के बिना अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया के लक्षित उपचार और विश्लेषण से जुड़ी कठिनाइयों के कारण अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के जीव विज्ञान को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है।
विट्रो में अलग-थलग न्यूरॉन्स की खेती तकनीकों में हालिया प्रगति अब माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के माध्यम से अक्षतंतु और कोशिका निकायों के द्रव पृथक्करण की अनुमति देतीहै। जैसा कि चित्र 1 ए में दर्शाया गया है, इन उपकरणों में चार एक्सेस कुएं (ए / एच और सी / आई) हैं, जिसमें प्रत्येक जोड़ी (डी और एफ) को जोड़ने वाले दो चैनल हैं। बड़े चैनल 450 μm लंबे माइक्रोचैनलों (e) की एक श्रृंखला द्वारा एक दूसरे के साथ जुड़े हुए हैं। दो कक्षों के बीच भरण स्तरों में जानबूझकर अंतर एक द्रव दबाव ढाल (चित्रा 1 बी) बनाता है जो चैनल से छोटे अणुओं के प्रसार को कम द्रव स्तर के साथ दूसरी तरफ रोकता है (चित्रा 1 सी, ट्रिपैन ब्लू डाई के साथ चित्रित)।
हमने हाल ही में एक्सोनल माइटोफैगी में स्थानीय अनुवाद आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग किया, क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया6 का चयनात्मक निष्कासन। वर्तमान प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III अवरोधक एंटीमाइसिन ए 6,7 का उपयोग करके अक्षतंतु के चयनात्मक उपचार के माध्यम से स्थानीय माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को प्रेरित करने के लिए विभिन्न चरण प्रस्तुत किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में अलग-अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को बीज और संस्कृति करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया का अलग से इलाज किया जा सके। झिल्ली-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एचए 7728/2-1 और एक्ससी 2145 प्रोजेक्ट आईडी 390857198) और मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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