マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極
Summary
本プロトコルは、マイクロ流体チャンバーにおけるニューロンミトコンドリアの播種および染色を記載する。これらのチャンバー内の流体圧力勾配により、軸索のミトコンドリアを選択的に処理して、細胞体コンパートメントに影響を与えることなく、薬理学的課題に応じてその特性を分析することができます。
Abstract
ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。ミトコンドリア機能障害は、多くの神経変性疾患において一般的な表現型である。いくつかの軸索の精巧な構造と極端な長さを考えると、軸索のミトコンドリアが細胞体のミトコンドリアと比較して異なる環境を経験する可能性があることは驚くべきことではありません。興味深いことに、軸索ミトコンドリアの機能不全はしばしば細胞体への影響に先行する。in vitroで軸索ミトコンドリア機能障害をモデル化するために、マイクロ流体デバイスは、体細胞ミトコンドリアに影響を与えることなく軸索ミトコンドリアの治療を可能にする。これらのチャンバー内の流体圧力勾配は、勾配に対する分子の拡散を防ぎ、軸索内の局所的な薬理学的課題に応じたミトコンドリア特性の分析を可能にします。現在のプロトコルでは、マイクロ流体デバイスにおける解離した海馬ニューロンの播種、膜電位感受性色素による染色、ミトコンドリア毒素による処理、およびその後の顕微鏡分析について説明しています。軸索生物学を研究するこの汎用性の高い方法は、多くの薬理学的摂動および画像読み出しに適用でき、いくつかのニューロンサブタイプに適しています。
Introduction
ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。神経細胞の健康はミトコンドリア機能と密接に関連しているため、これらの細胞小器官の機能不全の調節がパーキンソン病を含むさまざまな神経変性疾患の発症に関連していることは驚くべきことではありません1。さらに、ミトコンドリア中毒は、動物のパーキンソン病症状をモデル化するために首尾よく使用されています2。動物モデルとヒト疾患の両方で、ニューロンの終焉は遠位部3,4から始まり、軸索ミトコンドリアが侮辱を受けやすい可能性があることを示唆しています。しかし、軸索におけるミトコンドリアの生物学は、細胞体突起の同時障害なしに軸索ミトコンドリアの標的治療および分析に関連する困難のためによく理解されていない。
解離ニューロンのin vitroでの培養技術における最近の進歩により、マイクロ流体デバイスを介して軸索と細胞体の流体分離が可能になりました5。図1Aに示すように、これらのデバイスは4つのアクセスウェル(a/hとc/i)を備え、2つのチャネルが各ペア(dとf)を接続します。大きなチャンネルは、長さ450μmの一連のマイクロチャンネル(e)によって互いに接続されています。2つのチャンバー間の充填レベルの意図的な違いにより、流体圧力勾配が発生し(図1B)、流体レベルが低いチャネルから反対側への小分子の拡散を防ぎます(図1C、トリパンブルー染料で示されています)。
私たちは最近、マイクロ流体デバイスを使用して、損傷したミトコンドリアの選択的除去である軸索マイトファジーの局所翻訳要件を研究しました6。本プロトコールでは、ミトコンドリア複合体III阻害剤Antimycin A 6,7を用いた軸索の選択的処置を通じて局所ミトコンドリア損傷を誘導するための異なるステップが提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルは、軸索ミトコンドリアを別々に治療するためにマイクロ流体デバイス内で解離した海馬ニューロンを播種および培養する方法を記載する。膜感受性色素TMREと複合体III阻害剤Antimycin A(以前に実証された7)を用いたこのアプローチの有用性はここで実証されていますが、この方法は、局所的な顕微鏡ベースの読み出しを可能にする他のミトコンドリア色素またはミトコンドリア機?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツ研究財団(HA 7728/2-1およびEXC2145プロジェクトID 390857198)およびマックスプランク協会の支援を受けました。
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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