Mikrofluidikk-assistert selektiv depolarisering av aksonale mitokondrier
Summary
Denne protokollen beskriver såing og farging av nevronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene muliggjør selektiv behandling av mitokondrier i aksoner for å analysere deres egenskaper som svar på farmakologiske utfordringer uten å påvirke cellekroppen.
Abstract
Mitokondrier er de primære leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Mitokondriell dysfunksjon er en vanlig fenotype i mange nevrodegenerative sykdommer. Gitt noen aksoners forseggjorte arkitektur og ekstreme lengde, er det ikke overraskende at mitokondrier i aksoner kan oppleve forskjellige miljøer sammenlignet med deres cellekroppsmodeller. Interessant, dysfunksjon av aksonale mitokondrier går ofte foran effekter på cellekroppen. For å modellere aksonal mitokondriell dysfunksjon in vitro, tillater mikrofluidiske enheter behandling av aksonale mitokondrier uten å påvirke de somale mitokondriene. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene forhindrer diffusjon av molekyler mot gradienten, og muliggjør dermed analyse av mitokondrielle egenskaper som svar på lokale farmakologiske utfordringer i aksoner. Den nåværende protokollen beskriver såing av dissosierte hippocampale nevroner i mikrofluidiske enheter, farging med et membranpotensial følsomt fargestoff, behandling med mitokondrielt toksin og den påfølgende mikroskopiske analysen. Denne allsidige metoden for å studere aksonal biologi kan brukes på mange farmakologiske forstyrrelser og bildeavlesninger, og er egnet for flere neuronale subtyper.
Introduction
Mitokondrier er de viktigste leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Siden nevronhelse er nært knyttet til mitokondriell funksjon, er det ikke overraskende at dysfunksjonell regulering av disse organellene har vært assosiert med utbruddet av ulike nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsonssykdom. Videre har mitokondriell forgiftning med hell blitt brukt til å modellere Parkinsonske symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sykdom starter bortfallet av nevroner ved de distale delene3,4, noe som antyder at aksonale mitokondrier kan være mer utsatt for fornærmelser. Imidlertid er biologien til mitokondrier i axoner ikke godt forstått på grunn av vanskelighetene forbundet med målrettet behandling og analyse av aksonale mitokondrier uten samtidig forstyrrelse av cellekroppsprosesser.
Nylige fremskritt innen dyrkingsteknikker av dissosierte nevroner in vitro tillater nå fluidisk separasjon av aksoner og cellelegemer gjennom mikrofluidiske enheter5. Som vist i figur 1A, har disse enhetene fire tilgangsbrønner (a/h og c/i), med to kanaler som forbinder hvert par (d og f). De store kanalene er forbundet med hverandre med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Tilsiktede forskjeller i fyllingsnivåene mellom de to kamrene skaper en væsketrykkgradient (figur 1B) som forhindrer diffusjon av små molekyler fra kanalen med lavere væskenivå til den andre siden (figur 1C, illustrert med Trypan blått fargestoff).
Vi har nylig brukt mikrofluidiske enheter for å studere lokale oversettelseskrav i aksonal mitophagy, selektiv fjerning av skadede mitokondrier6. I denne protokollen presenteres forskjellige trinn for å indusere lokal mitokondriell skade gjennom selektiv behandling av aksoner ved bruk av mitokondriekomplekset III-hemmeren Antimycin A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å frø og dyrke dissosierte hippocampale nevroner i en mikrofluidisk enhet for å behandle aksonale mitokondrier separat. Nytten av denne tilnærmingen med det membranfølsomme fargestoffet TMRE og den komplekse III-hemmeren Antimycin A (som tidligere demonstrert7) er demonstrert her, men denne metoden kan enkelt tilpasses andre mitokondrielle fargestoffer eller genetisk kodede sensorer av mitokondrielle funksjoner som tillater lokale, mikroskop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av German Research Foundation (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
