一种检测产生硫化氢细菌的灵敏目视方法
Summary
在这里，我们提出了一种检测产生硫化氢的细菌的方案，其中包含用于硫化铋（BS）沉淀的改进方案。这种方法的主要优点是易于评估并且不需要专门的设备。
Abstract
硫化氢（H2S）是细菌在含硫氨基酸和蛋白质的蛋白水解过程中产生的有毒气体，对人体健康起着重要作用。H2S生产测试是重要的细菌生化鉴定测试之一。传统方法不仅繁琐耗时，而且由于含硫介质中重金属盐的毒性作用，容易抑制细菌生长，往往导致阴性结果。在这里，我们建立了一种简单灵敏的方法来检测细菌中的H2S。该方法是硫化铋（BS）沉淀的改进版本，使用96孔透明微量滴定板。将细菌培养物与含有L-半胱氨酸的铋溶液合并培养20分钟，最后观察到黑色沉淀。H 2 S的视觉检测限为0.2mM。基于视觉颜色变化，可实现产生H2S的细菌的简单，高通量和快速检测。总之，该方法可用于鉴定细菌中H2S的产生。
Introduction
产生硫化氢的细菌可以利用含硫氨基酸和蛋白质来产生硫化氢（H2S）。H2S 的产生通常发生在革兰氏阴性肠杆菌科细菌中，也发生在柠檬酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华氏菌属和希瓦氏菌属 1 的成员中。这些细菌有能力将硫酸盐还原成硫化氢（H2S）以获得能量。硫化氢与细菌耐药性的发展有关。H2S保护细菌免受活性氧（ROS）的毒性，从而拮抗抗生素的抗菌作用2，3。H2S在维持体内平衡方面也具有重要的生理作用。在超生理水平上，H2S已被证明对身体有深刻的毒性。在人体内，H2S作为气体信号分子具有另一个作用，参与各种生理和病理过程。H2S能调节心脏的收缩功能，在松弛血管、抑制血管重塑、保护心肌方面起重要的生理作用4，5。H2S在调节神经系统和消化道方面也起着重要作用6，7。已经发现，当暴露于杀菌抗生素时，细菌会产生致命的活性氧（ROS），导致细胞死亡8，9，10，11。
硫化氢试验作为微生物实验室课程中常见的生化检验，是鉴定细菌，特别是肠杆菌科细菌的重要实验。目前，硫化氢试验通常是在大量接种待测细菌的含硫氨基酸和醋酸铅培养基上进行的。孵育一段时间后（2-3天），通过观察培养基或醋酸铅纸条是否因醋酸铅产生而变黑来判断结果11。然而，这些传统方法不仅繁琐耗时，而且由于含硫介质中重金属盐的毒性作用，容易抑制细菌生长，往往导致阴性结果。已经建立了一种基于铋的方法用于检测H2S12，13。H2S能与铋反应，形成黑色硫化铋沉淀。为了对这种生化测试进行改革，需要建立一种对细菌生长没有副作用的简单快速的方法。在这里，我们建立了一种简单的方法来检测在 体外 环境中生长的产生硫化氢的细菌，使用硫化铋作为96孔微量滴定板格式的底物。
Protocol
Representative Results
Discussion
硫化氢生产试验是鉴定和分化细菌菌株的常规表型试验之一。许多细菌物种可以在其自然环境中产生硫化氢，例如水生水。这些细菌种类包括 沙门氏 菌属、 柠檬酸 杆菌属、 变形杆菌 属、 假单胞菌属、一些克 雷伯氏 菌属、 大肠杆菌和一些厌氧梭菌15，16。但传统H2S测试方法灵敏度低，耗时<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究得到了江苏省高等学校优先学术项目开发（PAPD）和中国药科大学教学改革研究项目（2019XJYB18）的支持。
Materials
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O’Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
