C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Summary

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

Abstract

C. elegans germline, kısmen disseke edilmiş hayvanlar üzerinde sitolojik analizler yapmanın kolaylığı nedeniyle, mayozu incelemek için mükemmel bir model oluşturur. Bütün montaj preparatları mayotik çekirdeklerin yapısını korur ve daha da önemlisi, her gonad kolu, çekirdekleri farklı aşamalarda tanımlamayı kolaylaştıran zamansal-uzamsal bir ilerlemede organize edilmiş mayozun tüm aşamalarını içerir. Yetişkin hermafroditlerin, her biri distal kapalı uçta çoğalan germline kök hücreleri ve proksimal açık uçta hücreselleştirilmiş oositler ile kapalı bir tüp olarak düzenlenmiş iki gonad kolu vardır ve bunlar uterusta merkeze katılırlar. Diseksiyon, vücut boşluğundan bir veya her iki gonad kolunu serbest bırakarak mayozun tamamının görselleştirilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen bir proteine karşı immünofloresan için ortak bir protokol sunulmakta, ardından tüm kromozomları işaretlemek için DAPI boyama yapılmaktadır. Genç yetişkinler levamisolde hareketsiz hale getirilir ve iki şırınga iğnesi kullanılarak hızla diseke edilir. Germline ekstrüzyonundan sonra, numune, kütikül ve diğer dokuların geçirgenleşmesine yardımcı olan sıvı azotta donma çatlağı geçirmeden önce sabitlenir. Numune daha sonra etanol içinde dehidre edilebilir, rehidre edilebilir ve birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edilebilir. DAPI, montaj ortamındaki numuneye eklenir, bu da DNA'nın güvenilir bir şekilde görselleştirilmesini sağlar ve floresan mikroskop altında görüntülenecek hayvanları bulmayı kolaylaştırır. Bu teknik, diseksiyon yönteminin kendisini uygulamak için harcanan birkaç saatten sonra C. elegans kullanımına aşina olanlar tarafından kolayca benimsenir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında çalışan lise ve lisans öğrencilerine öğretildi ve bir liberal sanatlar kolejinde ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimine dahil edildi.

Introduction

Mayoz, cinsel olarak üreyen tüm organizmalarda gametler (yumurta ve sperm / polen) oluşturmak için kullanılan özel hücre bölünmesidir ^1,2. Çapraz rekombinasyon, homolog kromozomlar arasındaki karşılıklı DNA değişimidir; mayozis için gereklidir, hem önemli bir genetik çeşitlilik kaynağı sağlar hem de nesiller boyunca genom stabilitesini teşvik eder. Mayoz sırasında en az bir çapraz geçiş oluşturamayan kromozomlar rastgele ayrılır, bu da kromozomun ayrılmamasına neden olabilir, yanlış sayıda kromozoma sahip gametler oluşturur - sonuçta ortaya çıkan soy³ için genellikle ölümcül olan bir durumdur. Mayoz sırasında, çapraz geçişler programlanmış çift sarmallı DNA kırılmaları⁴ tarafından indüklenir. Bu kırılmaların bir alt kümesi, hücre bölünmesi^5'e hazırlık olarak homolog kromozomların yönlendirilmesine yardımcı olan, chiasmata adı verilen DNA'nın fiziksel bağlantılarını sağlayan geçişler olarak onarılacaktır. Mayotik aşamalar tüm ökaryotlarda oldukça korunmuştur ve kromozomal konformasyonları kolayca tanımlanmalarını sağlar.

Biyolojide temel bir kavram olarak mayoz, öğrencilerin farklı biyoloji derslerinde birçok kez karşılaştıkları bir konudur. Genellikle lisede mayotik kromozom ayrışmasının mekaniğine tanıtılırken, üniversite düzeyindeki kurslar ayrışmanın hücre biyolojisine ve çapraz rekombinasyonun genetik etkisine odaklanır. Bununla birlikte, mayoz birçok öğrenci için kötü şöhretli bir şekilde zor bir kavramdır¹. Genler, DNA, kromozomlar ve mayoz arasındaki ilişkinin anlaşılmaması, genetik kalıtımın tam olarak anlaşılmasını engelleyen öğrenci yanılgılarına ve anlayış boşluklarına neden olabilir ^6,7. Öğrencinin soyut konulardaki anlayışını geliştirmenin bir yolu, somut, uygulamalı etkinlikler sağlamaktır. Örneğin, mayozu öğretirken, eğitmenler moleküler analiz^8'i taklit eden etkinlikler, öğrencilerin molekülleri^9'u manipüle etmelerine izin veren 3D modeller veya öğrencilerin moleküler^koreografiyi 1 yaptıkları rol yapma oyunları arasından seçim yapabilirler. Araştırmayı bilinmeyen sonuçlarla birleştirmek, öğrenci anlayışını geliştirmenin özellikle etkili bir yoludur. Bu uygulama, ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimi (CURE) olarak bilinir ve özellikle STEM^10,11'de yeterince temsil edilmeyen gruplara ait olanlar için öğrenci tutumlarını ve ajansını güçlendirme avantajına sahiptir. Nematod solucanı Caenorhabditis elegans, davranış, doğurganlık ve genetik haçlarla ilgili sınıf çalışmaları için özellikle uygundur ve öğrencileri biyolojik araştırmalarla tanıştırmak için etkili bir modeldir¹².

C. elegans, moleküler genetiği basit sitolojik analizle birleştirerek hücre biyolojisi için güçlü bir model organizma oluşturur. Ayrıca bir biyoloji sınıfında kullanım için özellikle uygundur ^13,14,15. Bir laboratuvarda bakımı kolay ve ekonomiktir, hem standart oda sıcaklığında hem de en yaygın inkübasyon sıcaklığı olan 20 ° C'de her 3 günde bir yüzlerce döl üretir. Daha da önemlisi, gliserol stokları olarak dondurulabilir ve -80 ° C'lik bir dondurucuda tutulabilirler, bu da acemi araştırmacılar tarafından yapılan herhangi bir hayvancılık hatasının kolayca düzeltilebileceği anlamına gelir¹⁶. Ayrıca, iyi açıklamalı genomu, ileri ve geri genetik tekniklere izin verir^17,18, C. elegans'ın molekülerden evrimsel olana kadar değişen biyolojik soruları ele almak için kullanılmasına izin verir. Son olarak, C. elegans araştırmacıları, tomurcuklanan bilim adamları için yardım ve tavsiye vermeye istekli olan destekleyici bir topluluk yarattılar¹⁹. Bu avantajlar, C. elegans'ın çeşitli kurum türlerinde bir dizi CURE'ye dahil edilmesine yol açmıştır 12,19,20,21,22,23.

Araştırma ve öğretim için faydalarına ek olarak, C. elegans mayoz ve germline gelişimi çalışmaları için popüler bir model haline gelmiştir^24,25,26. Bu hayvanların optik berraklığı, sitolojik yaklaşımları basitleştirir²⁷ ve yetişkinlerde, gonadlar hayvanın neredeyse yarısını temsil eder ve yüzlerce mayotik hücrenin incelenmesini sağlar. Gonadlarda, mayotik germline çekirdekleri bir montaj hattı gibi düzenlenir (Şekil 1); Mitotik replikasyon, gonadın distal ucunda meydana gelir, çekirdekler, döllenmiş embriyoların vulvadan çıktığı gonadın proksimal ucuna doğru göç ederken mayotik aşamalardan geçer. Stereotipleşmiş mekansal organizasyon aynı zamanda mayoz yoluyla zamansal bir ilerlemeyi temsil ettiğinden, kromozomal organizasyonlarına ve gonaddaki konumlarına bağlı olarak farklı aşamalar kolayca tanımlanabilir. Son olarak, mayozu bozan ve anöploidiye neden olan süreçler, acemiler için bile karakterize edilmesi kolay fenotipler yaratır: sterilite, embriyonik öldürücülük veya yüksek erkek insidansı (Him fenotipi)²⁸.

Bu, C. elegans'taki mayotik kromozomları görselleştirmek için basit bir protokoldür. Montaj, diseksiyon, sabitleme ve antikor boyama işlemlerinin hepsi aynı mikroskop slaydında gerçekleştirilir, bu da protokolü basitleştirir ve neredeyse mükemmel numune iyileşmesine izin verir. Bu yöntem, kromozomları görselleştirmek için basit DAPI boyama için çalışır ve gonaddaki proteinlerin lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan için kullanılabilir. Öğrenciler gonadları temel diseksiyon mikroskoplarını kullanarak parçalara ayırır, DNA veya immünofloresanın görselleştirilmesi için tam montajlı preparatlar üretir ve bunları bileşik bir floresan mikroskopta görüntüler. Bu protokol, bir C. elegans araştırma laboratuvarında çalışan lise öğrencilerine ve lisans öğrencilerine öğretildi ve bir liberal sanatlar kolejinde bir CURE^12'ye dahil edildi. CURE nispeten küçük bir sınıf büyüklüğüne sahip olmasına rağmen, bu protokol, solucan suşlarının ve reaktiflerinin nispeten düşük maliyeti nedeniyle bir dizi kurumdaki sınıflar için uygun olacaktır. Eğitmenler sadece kullanılabilecek diseksiyon mikroskoplarının sayısı ile sınırlı olacaktır. Önceki uygulama, tek bir mikroskobu paylaşmak için üçlü gruplar halinde çalışan öğrencilere sahipti ve üç 90 dakikalık oturumda gerçekleşti: birincisi diseksiyon uygulayan, ikincisi diseksiyon ve DAPI boyama uygulayan ve üçüncüsü slaytları geniş alan floresan mikroskobunda görüntülemek. Lisans araştırmalarına katılım, hem akademik hem de kişisel^{olarak 11,29} öğrencileri için birçok fayda sağlar. CURE'ler aracılığıyla derslere araştırma yerleştirmek, öğrencilerin normal ders saati 11,30,31 sırasında araştırmaya katılmalarını sağlar ve bu da bu faydalara maruz kalmayı daha erişilebilir ve adil hale getirir.

Protocol

1. C. elegans hayvancılık

NOT: Daha fazla ayrıntı için C. elegans bakım protokolü¹⁶ ve Elgin ve ^ark.32'ye bakınız. C. elegans suşları Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (https://cgc.umn.edu) kolayca edinilebilir ve ABD'deki herhangi bir yere normal posta yoluyla gönderilir. Her bir suşun maliyeti 10 ABD dolarıdır ve her laboratuvar / kullanıcı yıllık 30 ABD doları ücret öder.

1. Steril tekniği kullanarak 6 cm nematod büyüme orta boy agar plakaları (NGM agar plakaları) hazırlayın.
   NOT: Dökülen plakalar, orijinal plastik manşonlarında veya hava geçirmez kaplarda birkaç ay boyunca 4 ° C'de baş aşağı saklanabilir.
   1. NGM agar plakaları yapmak için 3 g NaCl, 2.5 g Bacto pepton, 20 g NGM agar ve ddH₂O ila 1 L (~ 975 mL) ekleyin. 20 dakika boyunca 121 °C'de tutulan bir sıvı döngüsü kullanarak ortamı otoklav edin. 55 °C'ye soğumaya bırakın ve steril tekniği kullanarak 1 mL kolesterol, 0.5 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄ ve 25 mL 1 M Potasyum fosfat tamponu (pH 6) ekleyin.
      NOT: 1 M Potasyum fosfat tamponu yapmak için, 108,3 g KH 2 PO 4 (monobazik)ve 35,6 g K₂HPO₄ (dibazik) karışımı; Gerekirse, KOH kullanarak pH'ı 6'ya ayarlayın. 1 L'ye kadar ddH₂O ekleyin (genellikle ~ 900 mL) ve 121 ° C'de 40 dakika boyunca otoklav yapın.
2. Serolojik veya transfer pipeti kullanarak, plakaları üç damla E.coli OP50 bakteri kültürü (~ 150 μL) ile tespit edin. Plakanın ortasını tespit etmeye çalışın ve plaka kenarlarına çok yakın lekeler yerleştirmekten kaçının; bu, hayvanların plakaların kenarlarını taramasını ve kurumasını engelleyecektir.
3. Bakteriyel çimler kuruduktan sonra, benekli plakaları oda sıcaklığında (RT) baş aşağı 2 haftaya kadar saklayın. Kullanmadan en az 1-2 gün önce plakaları lekelemek, bakteriyel çimlerin kalınlaşmasına ve daha yüksek bir hayvan yoğunluğunu desteklemesine izin verecektir.
   NOT: OP50 bakteri kültürlerini hazırlamak için, OP50 Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden sipariş edilebilir. OP50 bakterileri, tek koloniler sağlamak için bir gliserol stoğundan bir LB plakasına çizilir ve 4-6 hafta boyunca 4 ° C'de tutulur. OP50 bakteri kültürleri, tek bir koloniden 37 ° C'de gece boyunca LB'de yetiştirilir - sarsıntıya gerek yoktur. LB ortamını hazırlamak için, 10 g Tripton, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 950 mL ddH 2 O ekleyin, pH'ı 10 N NaOH ile 7'ye ayarlayın ve son hacmi ddH₂O. Aliquot ile 100-mL miktarlara ve 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav olarak ayarlayın.
4. Her suş için çalışan bir stok oluşturmak için, benekli bir NGM plakasına üç L4 aşamalı hermafrodit seçin. Plakaları 15-25 °C'de saklayın. Standart kültür koşulu 20 °C'dir. Sıcaklık kontrollü inkübatörlere erişim mümkün değilse, kültürleri RT'deki tezgahın üstünde tutun.
   NOT: L4 evreli hermafroditler, hem boyutlarına (yetişkinlerden daha küçük) hem de vücutlarının yarısına kadar ayrı bir yarım dairenin varlığına (gelişmekte olan vulva) göre kolayca sahnelenebilir. 20 ° C'de, hayvanlar yumurtadan çıktıktan 34-46 saat sonra L4 aşamasına ulaşacaktır (embriyolar döşendikten sonra yaklaşık 40-52 saattir). Gelişimsel aşamaların zamanlaması hakkında daha fazla ayrıntı için Corsi ve ^ark.14'e bakınız.
   1. Gelişim hızını kontrol etmek için kültürleri çeşitli sıcaklıklara kaydırın. Hayvanlar daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı büyür ve daha düşük sıcaklıklarda daha yavaş büyür. 25 °C'den yüksek sıcaklıklarda steril olmaya başlayacaklardır.
      NOT: Bazı mutant genotipler sıcaklığa duyarlıdır ve kültürleme sıcaklığına bağlı olarak farklı fenotipler gösterecektir.
5. Her 4 günde bir yeni benekli bir NGM plakasına üç L4 aşamalı hermafrodit toplayarak çalışma stoklarını koruyun. Bunu yapmak, çok çeşitli gelişim aşamalarına sahip sürekli, iyi beslenmiş bir nüfus sağlayacaktır.

2. Gonad diseksiyonu

1. Yaşla eşleşen yetişkinlerin toplanması: Diseksiyondan 12-24 saat önce, L4 evreli hermafroditleri yeni bir benekli NGM plakasına toplayın – bunlar ertesi gün genç yetişkinlere dönüşür, bu da diseksiyon için idealdir. L4 evreli hermafroditlerin sayısı, yapılan sitolojik analize bağlı olacaktır; Genellikle, slayt başına 10-20 hermafrodit disseke edilir ve koşul başına iki ila dört slayt üretilir.
   NOT: Gonadlar en verimli şekilde iyi beslenmiş hayvanlarda ekstrüde edilir. L4 hermafroditlerini aç bırakılmayan çalışan stoklardan seçtiğinizden emin olun (yani, plakada hala görünür bir bakteri çimi var). Aç bırakılan hayvanlar eksik gonad ekstrüzyonlarına maruz kalma eğilimindedir ve bu da onları görselleştirmeyi zorlaştırır.
   1. Diakinez gibi mayozun sonraki aşamalarını değerlendiriyorsanız, yaşlı yetişkinleri disseke edin (L4 sonrası 48 saat), çünkü daha fazla diakinez evresi çekirdeği biriktirirler ve analizi basitleştirirler. Bununla birlikte, araştırmacılar bazı etkilerin ileri anne yaşından kaynaklanma olasılığını not etmelidir.
2. Diseksiyon için hazırlanın.
   1. M9'u hazırlayın: 3 g KH 2 PO 4 (monobazik), 6 g Na 2 HPO₄ (dibasic), 5 g NaCl ekleyin ve 100 mL'ye ddH₂O ekleyin. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın, soğumaya bırakın ve ardından steril teknik kullanarak 1 mL'lik 1 M MgSO₄ ekleyin.
   2. Diseksiyon tamponunu hazırlayın: 1 μL %10 Ara 20, 12 μL 100 mM levamisol, 10 μL 10x M9 ve 77 μL ddH₂O karıştırın.
      NOT: Ara 20, yüzey gerilimini azaltmak ve doku zarlarını daha da geçirgenleştirmek için diseksiyon tamponuna dahil edilmiştir.
   3. Sabitleme çözeltisi hazırlayın (%2 PFA [100 μL]): 12,5 μL %16 paraformaldehit (PFA), 10 μL 10x M9 ve 77,5 μL ddH₂O karışımı; taze bir PFA ampulü kullandığınızdan emin olun (2 haftadan fazla açılmaz).
      DİKKAT: PFA tehlikeli bir kimyasaldır ve duman davlumbazında sabitleme çözeltisi hazırlanmalıdır.
   4. Donma yöntemini ayarlayın-sıvı azotun yönetimi daha kolaydır, ancak gerekirse kuru buzun üzerinde bir alüminyum blok kullanılabilir.
      1. Sıvı azot yöntemi: Bir polistiren kutuya plastik bir beher veya plastik bir Coplin kavanoz yerleştirin. Beheri sıvı azotla doldurun (polistiren kabın içine taşması iyidir). Cımbızı yakına ayarlayın. İdeal olarak, beher mikroskop slaytlarının tamamen yatay düşmesini önleyecek kadar dar olmalıdır - slaytlar bir eğimde yatmalı ve cımbızla kavranması kolay olmalıdır.
         NOT: Hızlı soğutma nedeniyle parçalanmayı önlemek için cam yerine sıvı azotla çalışırken plastik kaplar kullanmak önemlidir.
      2. Kuru buz yöntemi:
         1. Polistiren bir kaba veya dikdörtgen buz kovasına kuru buz üzerine düz bir alüminyum blok yerleştirin. Bloğun üst kısmı kabın üst kısmının üzerinde oturuyorsa, slaytları dondurmak daha kolaydır.
         2. Eldiven giyerek, kuru buzla iyi temas sağlamak ve soğutma işlemini hızlandırmak için alüminyum bloğa hafifçe bastırın (metal hızla soğudukça çığlık atabilir). Yakınlara bir tıraş bıçağı yerleştirin.
         3. Hızlı bir dondurma için gerekli olan tam soğumaya izin vermek için alüminyum bloğu donma-çatlak durdurmadan önce en az 30 dakika kuru buz üzerinde bırakın.
            NOT: İdeal olarak, yüzeyin düz kalmasına yardımcı olan katı kuru buz blokları kullanılmalıdır. Gerekirse, kuru buz topaklarına alüminyum blok yerleştirilebilir, ancak yüzeyin düz kalmasını sağlamak için özen gösterilmelidir.
         4. Alüminyum bloğun yüzeyi, slaytlar ve blok arasındaki yakın teması önleyebilecek don toplayacaktır. Yüzeydeki donları kazımak için tıraş bıçağını kullanın ve her slayt için bir alanı temizleyin. Polistiren kabın bir kapakla kaplanması, aşırı don birikiminin önlenmesine yardımcı olacaktır.
   5. Bir Coplin kavanozunu ~ 40 mL% 95 etanol ile doldurun.
   6. Üç Coplin kavanozunu ~ 40 mL PBS-T ile doldurun.
      NOT: PBS-T yapmak için 100 mL 10x PBS, 5 mL Triton X-100 ve 2 mL 0,5 M EDTA (pH 8) karıştırın. 873 mL ddH2O ekleyin. Triton X-100'ü çözmek için kuvvetlice sallayın. 10x PBS yapmak için, 25.6 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 80 gNaCl, 2 g KCl ve 2 g KH₂PO_4'ü karıştırın. Ses seviyesini₁₂₁°C'de 40 dakika boyunca 1 L. Otoklave'ye getirmek için ddH 2 O ekleyin. Deterjan Triton X-100, yüzey gerilimini azaltmak ve kızakta tamamen monte edilmiş hayvanların tutulmasını artırmak için PBS-T yıkama tamponuna dahil edilmiştir.
3. Hayvanları 18 mm x 18 mm cam kapak parçası üzerinde parçalara ayırın. Bu adım, diseksiyon tamponunun buharlaşması nedeniyle zamana duyarlıdır. Diseksiyonları bitirmek 5 dakikadan az sürmelidir.
   NOT: Levamisol, diseksiyonlarını kolaylaştırmak için hayvanları hareketsiz hale getirmek için kullanılır, ancak onları levamisolde çok uzun süre bırakmak zayıf gonad ekstrüzyonuna neden olur. 5 dakikalık zaman dilimine sığacak şekilde slayt başına disseke edilen hayvan sayısını azaltmak en kolay yoldur.
   1. Diseksiyon mikroskobunun sahnesine bir tutma slaytı yerleştirin - tutma slaydı kapak kaymasını daha kolay hareket ettirmek için kullanılır ve süresiz olarak tekrar kullanılabilir (Şekil 2A, sol fotoğraf).
   2. Kapak kaymasını tutma sürgüsünün üzerine yerleştirin ve diseksiyon çözeltisinin 4 μL'lik pipetini kapak kapağının ortasına yerleştirin. Görünümü boşaltmak için bekletme slaytını sahne alanının bir tarafına taşıyın.
   3. Diseksiyon çözeltisinin damlasına 10-20 hermafrodit seçin. Slayt başına ~ 10 görüntü oluşturmak için yeterli hayvanı seçin, ancak 5 dakika içinde disseke edilemeyecek kadar çok değil.
   4. Her el için bir tane olmak üzere iki şırınga iğnesi kullanarak hayvanları disseke edin (Şekil 2A).
      1. X şekli yapmak için iğnelerin noktalarını geçin ve bir yetişkini kapak kaymasının yüzeyine sabitlemek için X'in tabanını kullanın.
         NOT: Her iğneyi açı ve dönüş açısından tutmanın en iyi yolunu keşfetmek pratik gerektirebilir. İğneleri eğimleri (eğimli kenar) aşağı bakacak şekilde tutarak başlayın. Daha büyük bir ciltte incelemeyi ilk öğrenme önerileri için tartışmaya bakın (Şekil 2D).
      2. X şeklini farenksin hemen arkasına, genç bir yetişkinin vücut uzunluğunun yaklaşık 1 / 5'ine veya başın berrak kısmının hemen altına yerleştirin (Şekil 2A, sağ diyagram).
      3. Hayvanın kafasını tek bir makas hareketiyle kesin (yiyecekleri bıçak ve çatalla dilimlemek gibi). İyi bir ekstrüzyon, gonadın bir kolunun (veya bazen her iki kolun) bağırsakların bir veya iki yarısı ile birlikte vücut boşluğundan tamamen serbest bırakılmasına neden olur (Şekil 2B, sol resim). Bağırsak daha koyu ve düzgün genişlikte görünecek, gonad ise distal konik bir uçla net görünecektir.
         1. Her hayvan sadece bir kez kesilmelidir; Kesimi yaptıktan sonra gonad ekstrüzyon yapmazsa, sadece bir sonraki hayvana geçin. İlk kesim, vücuttaki hidrostatik basıncı önemli ölçüde azaltır, bu da daha fazla kesimin daha iyi bir ekstrüzyonla sonuçlanmasını olası kılmaz. Eksik veya zayıf ekstrüzyonlar görüntüleme sırasında kolayca görülebilir ve göz ardı edilebilir (Şekil 2B, sağ görüntü).
            NOT: Gonadı, karkastan ayırmaya çalışmayın, bunu yapmak genellikle dokuyu yırtacak ve analiz edilebilecek mayotik aşamaların sayısını sınırlayacaktır.
      4. Kapak kayması üzerinde kalan hayvanlar için diseksiyonu tekrarlayın.
4. Numuneyi formaldehit ile sabitleyin.
   1. Hafifçe çalışarak, kapaktaki sabitleme çözeltisinin 4 μL'lik pipeti, hayvanlarla damlaya çok yakındır. İdeal olarak, damlalar birleşecek kadar yakındır; doğrudan diseksiyon damlasına pipetlenmekten ve disseke edilmiş karkasların yerini değiştirmekten kaçının.
   2. Kapak kapağını tek parmağınızı kullanarak tutma kaydırağına sabitleyin. Öte yandan, damlaları karıştırmak için kapak kaymasını birkaç kez hafifçe kaydırın. Son düzeltme konsantrasyonu% 0.8 PFA'dır.
   3. Pozitif yüklü bir slaytı ön tarafı aşağı doğru tutarak, slaytın ortasındaki kapak kaymasını almak için kullanın. Numune damlasına hafifçe dokunun ve damlanın yüzey gerilimi kapak kaymasını alacaktır.
      NOT: Pozitif yüklü slaytlar, numune kaybını önlemek için dokuların yüzeye yapışmasına yardımcı olan elektrostatik bir kaplamaya sahiptir.
      1. İsterseniz, kapak kaymasını çapraz olarak konumlandırın, böylece bir köşe kızağın üst veya alt kenarından 1 mm sarkacaktır. Bir çıkıntı bırakmak, donduktan sonra kapağın kırılmasını kolaylaştıracaktır (Şekil 2C).
   4. Slaytı tezgaha yerleştirin ve RT'de tam 5 dakika boyunca sabitleyin. Bu süre zarfında, slaytı bir kalemle etiketleyin.
      NOT: Çekirdeklerden ve hatta tüm dokulardan antikorun dışlanması ile tespit edilebilen numunelerin aşırı sabitlenmesi yaygındır. Ek olarak, bazı antikorlar formaldehitlere karşı özellikle hassastır. Bu durumlarda, fiksasyon süresini azaltın veya kullanılan formaldehitin son konsantrasyonunu azaltın.
5. Donma-çatlak
   1. Düzeltmeden hemen sonra slaytları dondurun.
      1. Sıvı azot kullanıyorsanız: Kızağın etiketli kenarını cımbızla tutun ve yavaşça sıvı azot içine indirin. Slaytı, kabın yan tarafına yaslanacak, kapak tarafı yukarı bakacak şekilde serbest bırakın. Slaytlar 10 s içinde dondurulur (sıvı kaynamayı bıraktığında).
      2. Kuru buz kullanıyorsanız: donu alüminyum bloğun yüzeyinden bir tıraş bıçağı ile kazıyın. Kızağın etiketli kenarını sıkıca tutun ve blokla tam teması sağlamak için aşağı doğru bir miktar basınç uygulayarak temizlenmiş yüzeye yerleştirin. Kapak kayması tamamen blok yüzeyinde olmalıdır. Donma 10 saniye içinde gerçekleşir ve kapak kaymasının altındaki numune buza döndüğünde görsel olarak doğrulanabilir.
      3. Her iki yöntem için de, slaytları tamamen dondurmak için en az 5 dakika bekletin.
         NOT: Dondurulduktan sonra, slaytlar donmuş kaldıkları sürece sıvı azotta veya blokta 15-20 dakika bekletilebilir. Bu, çatlama adımına geçmeden önce bu aşamada birden fazla slaytın toplanmasını sağlar.
   2. Hızlı bir şekilde çalışarak, kapağı numuneden çıkarın. Bu adım zamana duyarlıdır. Kapak kapağını çıkarın ve numune çözülmeye başlamadan önce sürgüyü etanol içine batırın.
      1. Dondurulmuş slaytı çıkarın (sıvı azot için cımbız kullanarak).
      2. Kızağın etiketli kısa kenarını sıkıca tutun ve uzun bir kenarı tezgaha yaslayın.
      3. Öte yandan, bir tıraş bıçağını sıkıca tutun ve kapağı çıkarmak için tıraş bıçağının kenarını slayttan aşağı kaydırın. Bu adım, kapak kayması bir köşe çıkıntısı ile konumlandırılmışsa biraz daha kolaydır (Şekil 2C).
6. Slaytı hemen RT'de% 95 etanol içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin. slaytları en az 5 dakika etanol içinde bırakın.
   NOT: Slaytlar bir süre etanol içinde bırakılabilir - bu, yıkamalara devam etmeden önce bu adımda birden fazla slaytın toplanmasına izin verir. Slaytlar da bu adımda birkaç gün boyunca saklanabilir. Saklıyorsanız, Coplin sürgü kavanozunu etanol içinde -20 ° C'ye taşıyın.
7. Kızakları RT'de her biri 5 dakika boyunca PBS-T'de üç kez yıkayın. Her yıkama için taze PBS-T kullanın.
8. Antikorlarla boyama yapıyorsanız, adım 3'e (antikor boyama) geçin. Kromozomları görselleştirmek için sadece DAPI ile boyama yapıyorsanız, adım 4'e (montaj ve görüntüleme) geçin.

3. Antikor boyama

1. Birincil antikor inkübasyonu
   NOT: Yeni antikorlar için uygun koşulları belirlerken, floresan sinyalin özgüllüğünü doğrulamak için aşağıdaki negatif kontrolleri dahil etmek önemlidir: 1) Birincil antikorun bulunmayan ve yalnızca ikincil bir antikoru olan bir slayt; 2) sadece ikincil bir antikordan yoksun olan birincil antikoru olan bir slayt. Bu negatif kontrollerin her biri tam bir sinyal eksikliği üretmelidir. Sadece sekonder antikor slaytında floresan saptanırsa, sekonder antikor seyreltmesi arttırılmalı veya farklı bir sekonder kullanılmalıdır. Sadece birincil antikor slaytında floresan tanımlanırsa, muhtemelen otofloresan veya diğer potansiyel kirleticilerden kaynaklanmaktadır.
   1. Birincil antikoru antikor seyreltme tamponunda seyreltin (50 mg BSA + 50 μL% 10 sodyum azid + 10 mL PBS-T ) - slayt başına 20-30 μL kullanmak için yeterli antikor seyreltmesi hazırlayın.
   2. Nemli bir oda hazırlayın: Plastik bir kabın tabanını nemli kağıt havlularla hava geçirmez bir kapakla hizalayın. Kağıt havluların üzerine tek kat cam Pasteur pipetleri koyun. Bu pipetler, slaytların düz kalmasını sağlayan ve onları kağıt havlulardan yüksek tutan bir yüzey oluşturur.
      NOT: Nemli odalar için, çıtçıtlı kapaklı plastik gıda saklama kapları kullanmak en iyisidir, bu da içindeki slaytları bozmadan kabın açılmasını ve kapatılmasını kolaylaştırır. Pasteur pipetleri için yeterince uzun olan, ancak slaytların tamamen yatay durmasını sağlamak için girintisiz nispeten düz bir tabana sahip olanı arayın.
   3. Slaytı son PBS-T yıkamasından çıkarın. Numuneyi her zaman ıslak tutmak ve buharlaşmayı önlemek için bu adımdan itibaren hızlı bir şekilde çalışın. Örnek kurursa, antikor boyaması olumsuz yönde etkilenecektir.
   4. Kompakt bir dikdörtgene katlanmış bir silme dokusu kullanarak slaytın tüm yüzeyini kurulayın. Slaytın önünü ve arkasını silin, ancak numunenin etrafında bol miktarda boşluk bırakın. Numunenin yakınındaki yüzeyi kuruturken özel dikkat gösterin - numuneye çok yaklaşmaktan kaçının, bu da kapak kaymasının büyüklüğü hakkında bir alanı terk eder. Ancak, bir sonraki adım için numunenin çevresinin kuru olduğundan emin olun.
   5. Hidrofobik bir PAP kalemi kullanarak numunenin etrafına bir daire çizin. Tüm numune alanını içine almak için dikkatli olun, ancak slaytın yüzeyinde görünen hayvan karkaslarını bozmaktan kaçının. Bariyerin tamamen kurumasını sağlamak için ~ 5 s bekleyin.
      NOT: Birincil antikor çözeltisini içermek için hidrofobik bir bariyer gereklidir, çünkü kızağın yüzeyi bir deterjan içeren PBS-T ile kaplanmıştır. PAP kalemi kuru bir slayt yüzeyinde en iyi şekilde çalışır, bu nedenle numunenin etrafında kuru bir çevre oluşturmak önemlidir. Numuneye en yakın alanın kurutulmamış olarak bırakılması, bu adımda numuneyi korur
   6. Hızlı bir şekilde çalışarak, hidrofobik bariyer içindeki numuneden sıvıyı uzaklaştırmak için katlanmış silme dokusunun köşesini veya kenarını kullanın. Hayvan karkaslarını bozmamaya özen gösterin.
   7. Hemen hidrofobik bariyer tarafından oluşturulan halkaya birincil antikor çözeltisinin 20 μL'sini pipetleyin. Karkasların bozulmasını önlemek için hafifçe ve bir açıyla pipet çekmeye özen gösterin. Herhangi bir karkas üzerine doğrudan pipet takmaktan kaçının.
   8. Hidrofobik bariyer içindeki tüm yüzeyin çözelti tarafından kaplandığından emin olmak için sürgüyü yavaşça eğin.
      NOT: Hidrofobik bariyerlerin, antikor çözeltisinin 20 μL'si ile tamamen kaplanmış olan 1-1.5 cm'lik bir iç çevreye sahip olması en iyisidir. Çevre genişliği, karkasların donma-çatlak adımı sırasında nasıl dağıtıldığına bağlı olacaktır. Daha geniş bariyerler daha yüksek hacimli bir antikor çözeltisi gerektirebilir. İstenirse, numunenin üzerine küçük parafilm kareleri (18 mm x 18 mm kapak kayması boyutuna kadar kesilmiş) yavaşça yerleştirilebilir. Parafilm kareleri, antikor çözeltisinin tüm numuneyi kapsamasını sağlayacak ve ayrıca buharlaşmayı önlemeye yardımcı olacaktır.
   9. Slaytların geri kalanı için 3.1.3-3.1.8 arasındaki adımları yineleyin.
   10. Slaytları dikkatlice nemli odaya aktarın, çözeltinin hidrofobik bariyer içinde kalmasını ve slaytların tamamen düz durmasını sağlayın.
   11. Antikora bağlı olarak, bu adım 6 saate kısaltılabilir veya nemli odayı soğuk bir odada veya buzdolabında tutarak 4 ° C'de gece boyunca gerçekleştirilebilir.
       NOT: Nemli bir oda ve hidrofobik bariyerler kullanmak, uzun gece inkübasyonları için bile, antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için genellikle yeterlidir. Bununla birlikte, buharlaşmanın bir sorun olduğu kanıtlanırsa, her numunenin üzerine nazikçe küçük parafilm kareleri yerleştirilebilir ve bu da buharlaşmayı önlemeye yardımcı olur. Bunlar ilk yıkama adımında çıkarılabilir: Her slaytı PBS-T ile doldurulmuş bir Coplin kavanozuna batırın (başka slayt içermez) ve parafilmin numuneden uzaklaşmasına izin verin. Parafilmi bir sonraki slayttan çıkarmak için aynı kavanozu kullanmadan önce parafilmi Coplin kavanozundan çıkarın.
2. Slaytları ~ 40 mL PBS-T içeren Coplin kavanozlarında RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   1. Bu yıkamalar sırasında, ikincil antikoru antikor seyreltme tamponunda seyreltin. Slayt başına 20-30 μL kullanmak için yeterli antikor seyreltmesi hazırlayın. Alexa Fluor konjuge sekonjuge sekonder antikorların 1:200'de seyreltilmiş olarak kullanılması yaygındır.
3. İkincil antikor inkübasyonu
   1. Slaytı son PBS-T yıkamasından çıkarın. Numuneyi her zaman ıslak tutmak ve buharlaşmayı önlemek için bu adımdan itibaren hızlı bir şekilde çalışın.
   2. Katlanmış bir silme mendili kullanarak slaytı kurulayın. Hidrofobik bariyerin içerdiği alanı kurutmaktan kaçının.
   3. Hızlı bir şekilde çalışarak, hidrofobik bariyer içindeki numuneden sıvıyı uzaklaştırmak için katlanmış silme dokusunun köşesini veya kenarını kullanın. Hayvan karkaslarını bozmamaya özen gösterin.
   4. Sekonder antikor çözeltisinin 20 μL'sini derhal hidrofobik bariyer tarafından oluşturulan halkaya pipetleyin. Karkasların bozulmasını önlemek için hafifçe ve açılı bir şekilde pipetlemeye dikkat edin.
   5. Herhangi bir karkas üzerine doğrudan pipet takmaktan kaçının. Hidrofobik bariyer içindeki tüm yüzeyin çözelti tarafından kaplandığından emin olun. Daha geniş bariyer çevreleri daha yüksek hacimli bir antikor çözeltisi gerektirebilir. İsterseniz, numuneyi küçük bir parafilm karesi ile örtün (adım 3.1.8'in altındaki nota bakın).
   6. Slaytı dikkatlice nemli odaya aktarın, çözeltinin hidrofobik bariyer içinde kalmasını ve slaytın tamamen düz durmasını sağlayın. Sürgüyü karanlıkta tutmak için nemli odadaki kapağı yerine takın.
   7. Slaytların geri kalanı için 3.3.1-3.3.6 arasındaki adımları yineleyin.
   8. RT'de 4 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatın.
      NOT: Antikora bağlı olarak, bu adım 2 saate kısaltılabilir veya 6 saate kadar uzatılabilir. Nemli oda karanlık değilse, bir çekmeceye yerleştirin veya bir karton kutu ile örtün. Alternatif olarak, nemli oda, slaytları karanlıkta tutmak için alüminyum folyoya sarılabilir.
4. Slaytları ~ 40 mL PBS-T içeren Coplin kavanozlarında RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

4. Montaj ve görüntüleme

1. Montaj ortamı + DAPI (2 μg/mL), 18 mm x 18 mm cam kapaklar ve oje elinizin altında olacak şekilde numuneyi monte etmeye hazırlanın.
2. Slaytı son yıkamadan çıkarın ve katlanmış bir silme mendili kullanarak kurulayın. Hidrofobik bariyerin içerdiği alanı kurutmaktan kaçının.
3. Katlanmış silme dokusunun köşesini kullanarak, bariyerin içindeki numuneden sıvıyı dikkatlice uzaklaştırın. Bu adımda çoğu sıvıyı çıkarın, ancak karkasların tamamen kurumasına izin vermeden.
4. Hızlı çalışarak, numuneye 8 μL montaj ortamı ekleyin. Pipet, karkasların bozulmasını önlemek için nazikçe ve bir açıyla çalışır. Doğrudan karkasların üzerine pipet takmaktan kaçının.
5. Hala hızlı bir şekilde çalışırken, numunenin üzerine bir cam kapak kaymasını dikkatlice indirin.
   1. Hava kabarcıkları görüntülemeyi bozabilir ve numune bozulmasına neden olabilir. Hava kabarcıklarını en aza indirmek için, kapak kaymasının bir kenarını numunenin yanındaki slaytta bekletin, böylece numunenin üzerinde çapraz olarak tutulur. Kapak fişinin üst kenarının bir kalem veya cımbız üzerinde durmasına yardımcı olabilir. Daha sonra kapak kaymasının yüksek kenarını yavaşça aşağı indirin - bu hareket, montaj ortamının bir kenardan karşı kenara ilerleyen bir sıvı conta oluşturmasını sağlar.
6. Slaytların geri kalanı için 4.2-4.5 arasındaki adımları yineleyin.
7. Kapak fişlerini oje ile kapatın. Kapak kaymasına bastırmaktan (numuneyi ezecek) veya kapak kaymasını yatay olarak yerinden çıkarmaktan (numuneyi lekeleyecek) kaçınmaya dikkat edin.
   1. Bir kapak kapağının her köşesine küçük bir oje noktası ekleyin (~ 1 mm genişliğinde). Bunlar, kapak fişini yerinde tutmaya yardımcı olacaktır. Noktaların tamamen kurumasını bekleyin.
   2. Köşeler tamamen kuruduğunda, kenarları oje ile kapatın. Cilanın kapak kayması ve kızak arasındaki boşluğu tamamen doldurduğundan emin olun, ancak örtü kapağını çok fazla örtmekten kaçının. Kapak kayması üzerine 1 mm'lik bir örtüşme sağlamak en iyisidir. Sadece gerektiği kadar oje kullanın. Çok fazla kullanmaktan veya kuruması uzun zaman alabilecek ve mikroskop hedefine zarar verme riski taşıyan aşırı cila kullanmaktan kaçının.
      NOT: Şeffaf yerine renkli oje kullanılması tercih edilir, bu da contanın sınırını görmeyi kolaylaştırır ve oje sınırının altında yatan hayvanların görüntülenmesini önlemeye yardımcı olur.
   3. Görüntülemeden önce ojenin tamamen kurumasını bekleyin. Bu adım önemlidir, çünkü ıslak oje mikroskop hedeflerine ciddi şekilde zarar verebilir.
      NOT: Slaytlar bundan sonra mümkün olduğunca karanlıkta tutulmalıdır. Tezgahta kurudukça üzerlerini örtmek için düz bir karton kutu kullanın.
8. Görüntülemeden önce slaytları karanlıkta 1-2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın. Gerekirse, slaytları daha uzun süre -20 ° C'de saklayın.
9. Standart floresan bileşik ışık mikroskobu kullanan görüntü.
   1. Her slayt için, önce DAPI kanalında 10x'te tüm numuneyi inceleyerek iyi ekstrüde edilmiş gonadları tanımlayın ve yerleşimlerini not edin. Çoğu uygulama için, hayvanın başka bir kısmı tarafından kesilmiş, eksik veya kısmen kaplanmış gonadları görüntülemekten kaçının. Çoğu hayvan için, sadece bir gonad kolu tamamen ekstrüde edilmiş ve görünür olacaktır.
      NOT: Daha sonraki oryantasyon için kullanmak veya belirli çekirdeklerin konumunu tanımlamak üzere DAPI kanalındaki tüm gonadın 10 katında daha düşük büyütmeli bir görüntü çekmek yararlı olabilir.
   2. Uygulamaya bağlı olarak, görüntüler 40x, 63x veya 100x'te çekilebilir. Tüm gonad yakalanacaksa, çakışan sınırları olan bir montaj oluşturun. Görüntüleme sırasında, gonadın içi boş bir tüp olduğunu, çekirdeklerin üstte ve altta en yoğun olduğunu unutmayın.

Results

DAPI DNA'ya güçlü bir şekilde bağlanır ve boyanması çok çeşitli koşullar altında bile sağlamdır (Şekil 3A, B). Tüm çekirdeklerde bulunmalıdır ve bu nedenle slaytta herhangi bir solucan dokusunun varlığı ve mikroskopta floresan tespit etme yeteneği için etkili bir pozitif kontrol sağlar. Mayotik çekirdeklerde antikor bulunduğunda boyama etkilidir (Şekil 3A,B). Örneğin, Şekil 3A,B, DAPI ile boyanmış orta pakiten çekirdeklerini ve çift iplikli kırılmalar için bir belirteç olan RAD-51'i hedef alan bir antikoru göstermektedir. KLE-2, mitoz ve mayoza hazırlık olarak kromozomları yapılandıran yüksek oranda korunmuş bir protein kompleksi olan kondensinin bir bileşenidir. kle-2 / + mutantları, hafif düzensiz DAPI boyaması ve daha yüksek sayıda RAD-51 odağına yansıyan çift iplikli kırılma sayısındaki artışla gösterildiği gibi, kromozom yapısında küçük kusurlara sahiptir (Şekil 3B). İmmünofloresan için yaygın bir hata, numuneyi sabit çözeltide çok uzun süre bırakmaktır. Aşırı sabitleme, başarısız boyanmaya neden olabilir, çünkü genellikle antikorların çekirdeklere yayılmasını önler. Bu hata, antikor gonadın sitoplazmik bölgelerinde dağıldığında tanımlanabilir, ancak çekirdeklerden dışlanmış gibi görünmektedir.

Germline'de (Şekil 1), çekirdekler distal uçta mitotik olarak çoğalır, geçiş bölgesi sırasında mayoz girer ve diplotene ve son olarak diakinesis'e girmeden önce pachytene (genellikle birkaç çekirdek sırası tarafından üç eşit aşamaya bölünür) boyunca ilerler. Diakinezideki oositler, spermatheca'ya yakınlıklarına göre numaralandırılır, -1 oosit spermatheca'ya en yakın olanıdır, -2 oosit bir sonraki distaldir vb. C. elegans , diakinezi çekirdeklerinde kompakt oval olarak kendini gösteren altı kromozoma sahiptir. Bunların her biri, iki değerli olarak da adlandırılan bir kiazma tarafından bir arada tutulan homolog bir çift iki kardeş kromatidini temsil eder (Şekil 3C). Crossover oluşumunu bozan spo-11 gibi mutantlar chiasmata oluşturamaz; bu nedenle, diakinezi çekirdekleri, her kardeş kromatid için bir tane olmak üzere 12 ayrı DAPI gövdesine (tek değerli olarak da adlandırılır) sahip olacaktır (Şekil 3D).

Şekil 1: Germline çekirdekleri, mayoz yoluyla ilerlemelerini temsil eden mekansal-zamansal bir şekilde dizilmiştir . (A) DAPI ile boyanmış tam montajlı genç yetişkin hermafrodit. Gonad ve mayotik aşamalar, distal uçtan (yıldız işareti) spermatheca (üçgen) içeren proksimal bölgeye (okla gösterilen -1 oosit) kadar ana hatlarıyla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 100 μm. (B) DAPI ile boyanmış disseke hermafrodit gonadın yansıtılan floresan görüntüsünü temsil eder. Mayotik aşamalar, iç kümelerde gösterilen temsili çekirdeklerle gösterilir (tüm kümelerin birbiriyle ölçeklendiği gösterilmiştir). Çekirdekler, germ hattındaki konumlarına ve karakteristik kromozom morfolojisine bağlı olarak, distal uçtaki mitotik bölgeden (yıldız işareti), geçiş bölgesine, pakiten, diploten ve diakinez yoluyla ilerleyerek kolayca sahnelenebilir. Spermatheca bir üçgen ile işaretlenmiştir. Bu rakam Hillers ve ark.'dan CC BY 3.0²⁸ lisansı altında uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Diseksiyon kurulumunun gösterilmesi. (A) Diseksiyon sırasında mikroskop aşaması. Hayvanlar, tutma kaydırağına yerleştirilen ve kapak kaymasını görünüme taşımak için kullanılan bir kapak kayması üzerine 4 μL diseksiyon çözeltisi içinde diseke edilir. Diyagram ideal iğne yerleşimini gösterir. İğneler, faringeal bölgenin üzerinden geçirilmiş, aşağı bakan eğimli bir kenarla tutulur. Pembe oklar, iğneler için makas benzeri bir hareket gösterir. Pembe kesikli çizgi ideal kesim yerini gösterir. (B) Tam ekstrüzyon ve eksik ekstrüzyon örneği ile disseke edilmiş hayvanların görüntüleri. Ekstrüde gonadların ve bağırsakların bölümleri etiketlenir. (C) Donma-çatlak adımını gösteren resim. Slayt, bir elinizde sıkıca tutulmalı, kapak kayması tarafı gövdeden uzağa bakmalıdır. Karşı kenar tezgaha karşı desteklenir. Jilet diğer elde tutulmalıdır. Pembe ok, tıraş bıçağının kapak kaymasını slayttan kaydırması için hareket yönünü gösterir, böylece kapak kayması vücuttan uzaklaşacak şekilde hafif bir dönüş yapar. Kapak kaymasının, bir köşe kızağın uzun kenarı üzerinde asılı kalacak şekilde yerleştirildiğini unutmayın. (D) Bir cam embriyo boyama kabında diseksiyon uygulaması için kurulumun görüntüsü. Hayvanlar, buharlaşma problemini ortadan kaldıran ve diseksiyon süresini uzatan 50-200 μL diseksiyon çözeltisine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: (A) vahşi tip ve (B) kle-2/+ heterozigotlarda RAD-51 antikoru (yeşil) ve DAPI (kırmızı) ile boyanmış geç pakiten çekirdeklerinin (A,B) Z-yığın projeksiyonlarının germline çekirdeklerinin temsili floresan sonuçları. (C,D) (C) vahşi tipte (altı DAPI boyama cismi ile) ve (D) spo-11 mutantlarında (12 DAPI boyama gövdesi ile) DAPI ile boyanmış tek bir diakinezi çekirdeğinin Z-yığını projeksiyonları. Ölçek çubukları 5 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Cinsel üreme, mayozun özel hücre bölünmesi yoluyla üretilen haploid gametlerin oluşturulmasını gerektirir. C. elegans, optik şeffaflığı, uygun germline anatomisi ve güçlü genetiği nedeniyle mayozun sitolojik çalışması için popüler bir model haline gelmiştir²⁸. Doğurganlığı ve embriyonik öldürücülüğü değerlendiren basit organizma deneyleri, laboratuarda veya sınıfta birçok soruyu ele almak için moleküler genetik ile birleştirilebilir. Örneğin, geçitler uygun kromozom ayrışması için gerekli olduğundan, oluşumlarını veya çözünürlüklerini bozan süreçler anöploid gametler üretecektir. Buna karşılık, anöploidi, döl sayarak veya embriyonik ölümcüllüğü belirlemenin biraz daha karmaşık yöntemiyle kolayca değerlendirilebilen cansız soyuna yol açar. Sitolojik olarak, geçit eksikliği, diakinez sırasında gözlenen DAPI-boyama cisimlerinin sayısını etkileyecektir. DAPI boyamasının sağlamlığı ve puanlama kolaylığı, bunu sitolojik teknikleri öğretmek için ideal bir deney haline getirir. Hermafrodit germ hattındaki çekirdeklerin zamansal-uzamsal düzeni, zamanın tek bir anında mayozun her aşamasının anlık görüntüsünü sağlar. Çekirdeklerin germline'ın distal mitotik ucundan proksimal uca ilerlemesi yaklaşık 54 saat sürer (örneğin, bakınız Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 and Libuda et ^al.35). Mayotik ilerlemenin bu iyi bilinen zamanlaması, nabız kovalama etiketlemesine veya DNA'ya zarar veren deneylere izin verir.

DAPI boyama neredeyse her zaman çalıştığından, floresan mikroskobu için yararlı bir teknik kontrol görevi görür (ve eğitim gören mikroskopistler için memnuniyet sağlayabilir). Antikor boyaması daha değişken olabilir ve replikalar arasında tekrarlanabilirliğin iyi bir ölçüsüdür. C.elegans gonadlarının tutarlı bir şekilde düzeltilmesi zor olabilir, çünkü bu adım kromozomal yapının korunması arasında bir denge gerektirirken aynı zamanda yeterli antikor difüzyonuna izin verir. Formaldehit ile sabitleme, kromozomal morfolojiyi en iyi şekilde korur ve paraformaldehit ampullerinden taze formaldehit hazırlamak en tekrarlanabilir sonuçları sağlamıştır. Formalinden hazırlanan formaldehitin (% 37 sulu formaldehit ve metanol) kullanılması da mümkündür. Fiksasyon gücü ve zamanlamasının her antikor için ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Alternatif yöntemler, adım 2.4'te formaldehit fiksasyonunun atlanmasını ve donma çatlağını takiben, -20 ° C'de% 100 etanol içine daldırılmasını veya 10 dakika boyunca% 100 metanole daldırılmasını ve ardından -20 ° C'de 10 dakika boyunca% 100 asetona daldırılmasını içerir. Bu sabit koşullar daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir, ancak doku morfolojisini olumsuz yönde etkiler (kromozomlar şişirilmiş ve şişkin görünecektir).

Zamanlama, adım 2'de özetlenen diseksiyon ve düzeltme adımları için çok önemlidir. Diseksiyon çözeltisinin hacmi çok küçük olduğundan, buharlaşma son fiksasyon konsantrasyonunu etkileyebilir ve bu da değişken antikor boyamasına neden olur. Deneyimli bir C. elegans işleyicisi, düzeltmek için başlangıçtan itibaren 2 dakikadan daha kısa bir sürede (adım 2.3) bir slayt hazırlayabilir (adım 2.4). Ana teknik engel, hayvanları diseksiyon çözeltisinin damlasına toplama ve hızlı bir şekilde diseke etme yeteneğidir. Daha büyük hacimlerde nasıl diseksiyon yapılacağını öğrenmek daha kolay olabilir. Yeni kursiyerler ilk önce hayvanları bir cam embriyo boyama kabında 50-200 μL diseksiyon çözeltisine toplayarak başlarlar (Şekil 2D); daha geniş yüzey, iyi gonad ekstrüzyonları için ideal bir iğne pozisyonu belirlerken manevra yapmak için daha fazla alan sağlarken, daha büyük sıvı hacmi buharlaşmayı daha az sorun haline getirir. Diseksiyon hareketleriyle rahat olduktan sonra, kursiyerler çanakta sadece 50 μL kullanarak diseksiyona başlar, daha sonra bir slaytta 20 μL'de diseksiyona geçerler. Slaytlar üzerinde diseksiyon yaptıktan sonra, kursiyerler buharlaşmayı ihmal edilebilir hale getirmek için 4 μL'de çalışacak kadar hızlı olana kadar çözelti miktarını hızla azaltmaya başlayabilirler.

Diseksiyonun zamanlaması bir sorun olmaya devam ederse, kursiyerler adım 2.3 sırasında diseksiyon çözeltisinin 8 μL'sinde diseksiyon yapabilirler. Daha sonra, adım 2.4 sırasında, sabitleme çözeltisinin 8 μL'sini ekleyebilir, iyice karıştırmak için hafifçe pipetleyebilir (karkasların bozulmadığından veya pipetlenmediğinden emin olmak için yakından izleyebilir) ve karışık çözeltiden 8 μL'yi çıkarabilir. Bu alternatif yaklaşım, 8 μL'lik aynı nihai hacim ve aynı nihai sabitleme konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır; Bu hacim, adım 2.5'teki donma çatlağı sırasında karkasların hem kapak kayması hem de kayma yüzeyine temas etmesini sağlamak için önemlidir. Her slaytın hazırlanmasının zamanlaması daha büyük diseksiyon hacimlerinde bile bir sorun olmaya devam ederse, Germline immünofloresan protokolü için bir süspansiyon yöntemi Gervaise ve Arur²⁶ tarafından tanımlanmıştır.

Proteinleri in situ görselleştirmek için immünofloresan kullanmanın en büyük sınırlaması, ilgilenilen belirli bir proteini hedef alan birincil antikorların mevcudiyetidir. Bununla birlikte, proteinin etiketli bir versiyonu tasarlanmışsa, bu protokol protein etiketini görselleştirmek için uyarlanabilir. FLAG, HA veya GFP gibi yaygın etiketleri hedefleyen antikorlar yaygın olarak bulunur. GFP gibi floresan etiketler genellikle fiksasyon adımlarıyla söndürülebilir, bu nedenle doğal floresan sinyalinin kendisine güvenmek yerine GFP'yi hedefleyen birincil bir antikor kullanılması önerilir. Bu protokolün bir başka sınırlaması, germ hattını tek bir zaman dilimi içinde yakalamasıdır (oogenezin tüm aşamaları germ çizgisi içinde temsil edilmesine rağmen). Bu nedenle, bu teknik, bir oosit oogenez yoluyla ilerledikçe ortaya çıkabilecek dinamik değişiklikleri kaçırabilir. Bununla birlikte, gametogenezin zamanlaması C. elegans'ta iyi çalışılmıştır; Vahşi tip genç bir yetişkinde, bir yumurtanın germline'ın distal ucundan (mitotik bölge) diyakinezi^33'e ilerlemesi yaklaşık 60 saat sürer. Bu nedenle, bir nabız kovalaması veya ışınlama gibi spesifik bir müdahalenin ardından bir zaman seyri, mayozun farklı aşamalarındaki etkilerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Sonuç olarak, bu protokol C. elegans gonad diseksiyonunu takiben DAPI ve floresan mikroskopi için antikor boyamasını tanımlamaktadır. Diseksiyon ve sabitleme (adım 2), oluşturulan slayt sayısına bağlı olarak 60-90 dakika sürer. Antikor boyama (adım 3) çoğunlukla eller kapalıdır ve antikor inkübasyon sürelerine bağlı olarak en az 7 saat ila 1.5 gün arasında değişebilir. Montaj (adım 4.1-4.7) yaklaşık 15 dakika sürer. Germline kromozomlarını ve gonadı görselleştirmeye yönelik bu genel yaklaşım, bir antikor veya floresan etiket reaktifi varsa, herhangi bir proteinin sitolojik çalışmaları için kullanılabilir. En basit haliyle, diakinezi çekirdeklerinin DAPI boyaması, mayotik rekombinasyonu etkileyen faktörleri taramak için kullanılabilir. Döl sayısının organizma analizleri, erkeklerin insidansı (Him fenotipi) ve embriyonik öldürücülük ile eşleştirildiğinde, bu sitolojik yaklaşım, popülasyon bazlı analizlere tek hücreli bir karşı nokta sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavşan IgG İkincil Antikor	Moleküler Problar	711-545-152
Alüminyum ısıtma/soğutma bloğu	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Borosilikat Cam Pastör Pipetleri, Tek Kullanımlık, 5.75 inç	Fisherbrand	13 678 20B	Solucan kazmaları yapmak için kullanılır
BSA, Sığır Serumu Albümin	VWR	97061 420
C. elegans vahşi tip (ata)	Caenorhabditis Genetik Merkezi	N2 (ata)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutantlar	Caenorhabditis Genetik Merkezi	VC768	Bu suşun tam genotipi şöyledir: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Farangeal GFP ile işaretlenmiş bir dengeleyici kromozom ile kle-2 dengelidir. Homozigot kle-2 mutantlarını tanımlamak için yeşil olmayan hayvanları seçin.
C. elegans spo-11 (me44) mutantlar	Caenorhabditis Genetik Merkezi	TY4342	Bu suşun tam genotipi: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). Farangeal GFP ile işaretlenmiş bir dengeleyici kromozom ile dengelenmiş spo-11'e sahiptir. Homozigot spo-11 mutantlarını tanımlamak için yeşil olmayan hayvanları seçin.
Kalsiyum Klorür Susuz	VWR	97062 590
Kolesterol	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Yaşam Teknolojileri	D1306
EDTA, Disodyum Dihidrat Tuzu	Apex Biyoaraştırma Ürünleri	20 147
Embriyo Tabağı, cam, 30mm boşluklu	Elektron Mikroskobu Hizmetleri	100492-980	Diseksiyon pratiği yapmak için kullanılır; cam tercih edilir, çünkü disseke hayvanlar plastiğe yapışabilir
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetik Merkezi	OP50
Gıda saklama kabı, plastik	çeşitli	n/a	Slaytların düz durmasını sağlamak için (1) nispeten düz tabanlı plastik kaplar; (2) hava geçirmez, ancak yine de kabın içeriğini rahatsız etmeden kolayca çıkarılabilen ve (3) yaklaşık 9 inç uzunluğunda ve 6 inç genişliğinde kapaklar tercih edilir
Cam Coplin Kavanoz	DWK Yaşam Bilimleri  Wheaton	08-813E
Hidrofobik Bariyer PAP Kalem	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Levamizol Hidroklorür	Sigma Aldrich	L0380000
Magnezyum Sülfat Susuz	Fisher Chemical	M65 500
İğneler, Tek Kullanımlık, 25 G	BD PrecisionGlide	14 821 13D	mavi, 1 inç
NGM Agar, Granül	Apex Biyoaraştırma Ürünleri	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldehit (%16 a/h) Sulu Çözelti	Elektron Mikroskobu Bilimleri	50 980 487
PBS, Fosfat Tamponlu Salin (10x Çözelti)	Fisher BioReagents	BP399500
Petri Kapları, 60 mm	Tritech Araştırma	NC9321999	Havalandırmasız, keskin kenarlı
Platin tel (%90 platin, %10 iridyum)	Tritech Research	PT 9010	Solucan kazmaları yapmak için kullanılır
Potasyum Klorür	Fisher	BP366-500
Potasyum Fosfat Dibazik	VWR BDH Kimyasalları	BDH9266 500G
Potasyum Fosfat Monobazik	VWR BDH Kimyasalları	BDH9268 500G
Premium Kapak Camları 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0.13– 0,17 mm kalınlığında
Tıraş Bıçakları, Tek Kenarlı	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant	Moleküler Problar	S36937	Alternatifler: VectaShield Antifade Montaj Ortamı (Vector Laboratories, H-1000-10) veya ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). ProLong Diamond kullanılıyorsa, sızdırmazlık için oje gerekmez, ancak slaytlar görüntülemeden önce 24 saat kürlenmelidir.
Sodyum Azide	Fisher BioReaktifler	BP922I 500
Sodyum Klorür	Fisher Kimyasal	S271 500
Sodyum Fosfat Dibazik Susuz	Sigma Aldrich	7558 79 4
Sodyum Fosfat Dibazik Heptahidrat	Sigma Aldrich	S9390
Strafor kutusu	çeşitli	n / a	Yaklaşık iç mekan boyutları: 12 inç uzunluğunda, 9 inç genişliğinde, 8 inç derinliğinde
Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100 Fisher	BioReagents	BP151 500
Tripton	Apex Bioresearch Ürünleri	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Maya Özü	Apex Biyoaraştırma Ürünleri	20 254