באופן קלאסי, האנדוקרדיום של פרימורדיום המסתם העוברי של העכבר נותח באמצעות חתכים רוחביים, קורונליים או סגיטליים. הגישה החדשנית שלנו להדמיה דו-ממדית של האנדוקרדיום באזורים וולוולוגניים מאפשרת קוטביות מישורית וניתוח סידור מחדש של התאים של האנדוקרדיום במהלך התפתחות המסתם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפתחות לב היונקים חיוני לטיפול במחלות לב מולדות אנושיות. התפתחות מסתמי הלב הפרימיטיביים כרוכה במעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT) של תאים אנדוקרדיאליים מאזורי התעלה האטריובנטריקולרית (AVC) ודרכי היציאה (OFT) של הלב בתגובה לאותות שריר הלב והאנדוקרדיאליים האינדוקטיביים המקומיים. ברגע שהתאים מתפרקים ופולשים למטריצה החוץ-תאית (ג'לי לבבי) הממוקמת בין האנדוקרדיום לשריר הלב, נוצרות כריות אנדוקרדיאליות פרימיטיביות (EC). תהליך זה מרמז על כך שהאנדוקרדיום צריך למלא את הפערים שהותירו התאים הדה-לאומיים ועליו לארגן את עצמו מחדש כדי להתכנס (להצטמצם) או להתארך (להאריך) לאורך ציר. המחקר הנוכחי עירב את מסלול קוטביות התאים המישוריים (PCP) בוויסות הלוקליזציה התת-תאית של הגורמים המעורבים בתהליך זה. באופן קלאסי, השלבים הראשונים של התפתחות מסתמי הלב נחקרו בחתכים של לבבות עובריים או בצמחי ex vivo AVC או OFT שגודלו בתרבית על ג'ל קולגן. גישות אלה מאפשרות ניתוח של קוטביות אפיקו-בסיסית, אך אינן מאפשרות ניתוח של התנהגות התא בתוך מישור האפיתל או של השינויים המורפולוגיים של תאים נודדים. כאן, אנו מראים גישה ניסיונית המאפשרת הדמיה של אנדוקרדיום באזורים valvulogenic כשדה מישורי של תאים. גישה ניסיונית זו מספקת את ההזדמנות לחקור PCP, טופולוגיה מישורית ותקשורת בין-תאית בתוך אנדוקרדיום של OFT ו- AVC במהלך פיתוח שסתום. פענוח מנגנונים תאיים חדשים המעורבים במורפוגנזה של מסתמי הלב עשוי לתרום להבנת מחלות לב מולדות הקשורות למומים בכרית הלב האנדוקרדיאלית.
מבוא
הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון של עובר יונקים. בסביבות היום העוברי (E) 7.5 בעכברים, תאי מזודרם קדם-לבביים דו-צדדיים יוצרים את הסהר הלבבי בצד הגחוני1. הסהר הלבבי מכיל שתי אוכלוסיות של תאים קדם-לבביים הכוללים אבות של שריר הלב והאנדוקרדיום2. בסביבות E8.0, מבשרי הלב מתמזגים בקו האמצע, ויוצרים את צינור הלב הפרימיטיבי המורכב משתי רקמות אפיתל, שריר הלב החיצוני והאנדוקרדיום הפנימי, שהוא אנדותל מיוחד המופרד על ידי מטריצה חוץ-תאית בשם ג'לי לב. מאוחר יותר, ב- E8.5, צינור הלב עובר לולאה ימינה. ללב הלולאה יש אזורים אנטומיים שונים עם חתימות מולקולריות ספציפיות כגון מערכת הזרימה (OFT), החדרים והתעלה האטריו-חדרית (AVC)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המרכז הלאומי לניסויים בבעלי חיים (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ועל ידי קהילת מדריד (ref. PROEX 155.7/20). כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU והמלצה 2007/526/EC בנוגע להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות, שנחקקו בחוק הספרדי תחת Real Decreto 1201/2005.
1. הסתרה של AVC ו / או OFTs (מותאם מ Xiao et al. 25)
- הגדר צלבים אחר הצהריים בין mTmG נקבה לבין זכר VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
- למחרת בבוקר, בדוק אם יש תקע נרתיקי. אם יש תקע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הנתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מראים כי ניתן לבצע הדמיה פנים אל פנים של אנדוקרדיום של AVC. המטרה הראשונה הייתה לנתח את צורת התא של האנדוקרדיום במהלך היווצרות השסתומים ברזולוציה תאית (איור 1). כדי להדגיש תאים אנדוקרדיאליים בודדים ב-E9.5, השתמשנו בשני זני עכברים מהונדסים. (1) ROSAmT/mG הוא אלל כתב Cre פלואורסצנטי בעל שני צבעים (tdTomato/mT ו-EGFP/mG) שהפלואורסצנטיות שלו מתגלה בקרום התא. ללא הפעלה בתיווך Cre, הטרנסגן מבטא tdTomato (mT).......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנדוקרדיום הוא מונולאייר אפיתל המכסה את כל פני השטח הפנימיים של צינור הלב העוברי. במהלך התפתחות המסתם, תאים אנדוקרדיאליים באזורים הוולוולאריים הפרוספקטיביים עוברים EMT, וכך תאים אנדוקרדיאליים הופכים ומסדרים מחדש את השלד הציטוסקולרי שלהם כדי להתפרק מהאנדוקרדיום לכיוון ג'לי הלב. אנו ואחרים השגנו נתונים רלוונטיים על התפתחות שסתומים בעוברי עכברים על ידי ניתוח מקטעים רוחביים של לבבות עובריים E8.5 ו- E9.5, שבהם האנדוקרדיום מוצג כשורה של תאים 6,8,24,32.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים PID2019-104776RB-I00 ו- CB16/11/00399 (CIBER CV) מ- MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ל- J. L. P. J.G.-B. מומן על ידי Programa de Atracción de Talento מקומונידד דה מדריד (2020-5ª/BMD-19729). ט.ג.-ג. מומן על ידי Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). אנו מודים ליחידת CNIC של מיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, ICTS-ReDib, במימון משותף של MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ו- FEDER "דרך להפוך את אירופה" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). אנו מודים גם לא' גליציה ול' מנדס על גידול העכברים. עלות פרסום זה נתמכה בחלקה על ידי כספים מהקרן האירופית לפיתוח אזורי. ה- CNIC נתמך על ידי ISCIII, MCIN וקרן Pro CNIC והוא מרכז מצוינות של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16% Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | מדלל ל-4% במים |
| אנטי-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| עיזים נגד עוף, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| עז נגד עכבר Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| שקופיות Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1.0 מ"מ |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield הרכבה | מעבדות וקטור | H-1000-10 |
מקורות
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
