Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.
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Methodenartikel
Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.
Einleitung
Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs....
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Protokoll
1. Plasmidaufbau
- Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20.
- Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Standorten BamH I und EcoR I, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten....
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Ergebnisse
Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen.
Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5'-Terminal des RBD-Gens mi.......
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Diskussion
Um eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Antigenen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ampicillin-Natrium-Sangon | Biotech | A610028 | |
| Automatisierter Zellzähler | Countstar | BioTech | |
| BCA-Protein-Quantifizierungskit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Elektrophoresegerät | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Puffer H 10X TBST Puffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Ziege pAb zur Maus IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag Maus mAb | Zellsignaltechnologie | 2366s | |
| Imidazol | Sangon Biotech | ||
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosid | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Fettfreies Milchpulver | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 Zellkulturmedium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST Plasmid | Wuhan genecreat Biologische Technologie | ||
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimin Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Vorgefärbte Proteinleiter | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC Plasmid | Wuhan genecreat biologische Technologie | ||
| PVDF Western Blotting Membranen | Roche | ||
| Quixstand Tischsysteme (100 kD Hohlfasersäule) | GE Healthcare | ||
| SDS-PAGE Ladepuffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Natriumchlorid | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (verbesserte Chemilumineszenzlösung) | Thermo | 34577 | |
| Suspensionsinstrument | Life Technology | Hula-Mischer | |
| Transmissionselektronenmikroskop | Hitachi | HT7800 | |
| Trypton-Oxoid-LP0042B | |||
| Ultrazentrifuge | Beckman-Schar | XPN-100 | |
| Ultraviolett-Spektralphotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Hefeextrakt | Sangon Biotech | A610961 |
Referenzen
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
