본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.
마우스의 신피질에서 나온 광시야 칼슘 이미징을 통해 다양한 뇌 기능과 관련된 피질 전체의 신경 활동을 관찰할 수 있습니다. 반면에 이광자 이미징은 단일 세포 수준에서 국소 신경 회로의 활동을 해결할 수 있습니다. 동일한 마우스에서 두 이미징 기술을 사용하여 다중 스케일 분석을 수행하려면 큰 두개골 창을 만드는 것이 중요합니다. 이를 위해서는 두개골의 큰 부분을 제거하고 노출 된 피질 표면을 투명한 물질로 덮어야합니다. 이전에는 유리 두개골과 폴리머 기반 두개골 창이 이러한 목적으로 개발되었지만 이러한 재료는 쉽게 제작되지 않습니다. 본 프로토콜은 시판되는 폴리염화비닐리덴(PVDC) 포장 필름, 투명 실리콘 플러그 및 커버 글라스로 구성된 대형 두개골 윈도우를 만드는 간단한 방법을 설명한다. 전체 반구의 등쪽 표면을 이미징하기 위해, 창 크기는 대략 6 x 3mm2였다. 심한 뇌 진동은 그러한 큰 창문에 관계없이 관찰되지 않았습니다. 중요한 것은 뇌 표면의 상태가 한 달 이상 악화되지 않았다는 것입니다. 특히 성상 세포에서 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표 (GECI) 인 GCaMP6f를 발현하는 마우스의 광시야 이미징은 수 밀리미터에서 동기화 된 반응을 나타 냈습니다. 동일한 마우스의 이광자 영상은 몇 초 동안 개별 성상 세포에서 두드러진 칼슘 반응을 보였다. 또한, 아데노 관련 바이러스의 얇은 층을 PVDC 필름에 적용하고 두개골 창 위의 피질 뉴런에서 GECI를 성공적으로 발현했습니다. 이 기술은 큰 두개골 창을 만드는 데 신뢰할 수 있고 비용 효율적이며 거시적 및 미시적 수준에서 행동 중 신경 및 신경교 역학과 상호 작용의 조사를 용이하게합니다.
광시야 칼슘 영상은 동물 뇌의 넓은 영역에 걸쳐 시공간 활동 패턴을 효과적으로 조사합니다 1,2,3. 광시야 이미징은 설치류의 피질이 비교적 평평하기 때문에 설치류의 전체 피질 표면을 관찰하는 데 광범위하게 사용되었습니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10. 트랜스제닉 마우스 또는 뉴런 및 신경교세포와 같은 다양한 세포에서 GECI를 특이적으로 발현하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 주사한 마우스는 광시야 칼슘 영상화11,12,13에 사용될 수 있다. 그러나, 이 기술의 공간 분해능은 일반적으로 생체내14에서 개별 세포의 활성을 해결하기에 충분하지 않다. 또한 더 깊은 층에 위치한 이미징 셀에도 적합하지 않습니다.
한편, 이광자 칼슘 이미징은 세포 내 공간 분해능으로 동시에 여러 세포의 활동을 관찰 할 수있어 신경 수상 돌기 및 신경교 과정 15,16,17,18,19,20,21,22에서도 개별 세포의 활동을 관찰 할 수 있습니다. 또한 대뇌 피질(23,24)의 더 깊은 층에있는 세포를 관찰 할 수 있습니다. 2 광자 현미경의 최근 기술 발전으로 밀리미터 폭 피질 영역25,26,27,28,29에서 이미징이 가능하지만 2 광자 이미징에 의한 광시야 이미징에 필적하는 영역을 관찰하는 것은 여전히 어렵습니다.
단일 세포에서 전체 뇌로의 뇌 활동의 생리적 관련성을 이해하려면 전체 피질에 걸친 피질 영역의 활동과 국소 신경 회로의 단일 세포 분해능 사이의 격차를 해소하는 것이 중요합니다. 따라서 동일한 마우스에서 수행되는 광시야 및 2광자 칼슘 이미징의 조합이 특히 효과적입니다. 이를 실현하려면 이상적으로 장기간에 걸쳐 넓고 안정적인 두개골 창을 만들어야합니다.
이전에는, 동일한 마우스(30, 31)에서 광시야 및 이광자 이미징이 수행될 수 있도록 두개골 윈도우를 만들기 위한 몇몇 기술이 개발되었다. 제거된 뼈를 대체하기 위해 피질 표면의 형상으로 성형되는 사다리꼴 형상의 커버 유리 윈도우(crystal skull)는 전체 피질(32)에 걸친 광학 접근을 허용한다. 대안적으로, 중합체-기재 두개골 창은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)33 또는 폴리에틸렌-옥사이드-코팅된 비정질 플루오로중합체 나노시트(34)로 제조될 수 있다. 각 방법은 1 개월 이상 안정적인 창을 유지하는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 창문을 생산하는 것은 쉽지 않으며 사용되는 재료와 장비는 종종 비쌉니다.
본 연구는 PVDC 필름(플라스틱 식품 랩)을 사용하여 대형 두개골 창을 만드는 새로운 방법을 설명합니다(그림 1). 이 창을 사용하여 생체 내 광시야 및 이광자 이미징 실험을 동일한 마우스에서 수행할 수 있습니다. 또한 GECI는 랩에 AAV 입자를 포함하는 얇은 필름 층을 형성하여 마우스 피질의 넓은 영역에 걸쳐 뉴런에서 발현 될 수 있음이 밝혀졌습니다.
이 기사에서는 PVDC 플라스틱 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 대형 두개골 창을 만드는 저렴한 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하여 우리는 대뇌 피질의 넓은 영역에서 광역 칼슘 이미징을 수행 할 수 있음을 보여주었습니다. 이광자 칼슘 영상은 광시야 영상화를받은 동일한 마우스의 여러 다른 피질 영역에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 창에 사용 된 플라스틱 랩의 피브로인 -AAV 필름은 피질의 넓은 영역에서 GECI를 발현 할 수 있음이 밝혀졌습니다.
중요 단계
플라스틱 랩을 사용하여 두개골 창을 만들 때 감염과 뇌 손상을 피하는 것이 중요합니다. 이러한 조건에서는 신경 및 신경교 활동을 관찰 할 수 없으며 더 깊은 영역의 이미징이 불가능합니다. 혈관 손상은 또한 출혈을 일으켜 혈액으로 인해 영상이 불가능합니다. 감염을 피하려면 ACSF를 빨아들여 뇌 표면과 랩을 가능한 한 단단히 부착하는 것이 중요합니다. 만니톨 투여는 수술 중 뇌압 상승을 방지하여 뇌 및 혈관 손상을 방지하는 데 중요합니다. 이것은 뇌 표면과 경막 사이의 공간을 유지하고 두개골과 경막을 제거하는 동안 뇌와 혈관이 만지는 것을 방지합니다. 고배율의 실체 현미경과 끝이 날카로운 핀셋도 정확한 수술에 효과적입니다.
피브로인-AAV 방법에서는 피브로인 용액을 동결시키지 않고 피브로인-AAV 용액을 충분히 건조시키고 충분한 양의 용액(직경 3mm당 5μL)을 도포하기 위해 살누에 고치를 사용하는 것이 필수적입니다. 오래된 고치를 사용했을 때 표현 효율이 낮았습니다. 오래된 고치의 피브로인이 쉽게 변성될 수 있기 때문입니다. 피브로인 용액을 -80°C에서 동결시키고 사용시에 해동시킨 경우, 발현 효율이 불량하였다. 이것은 동결 및 해동으로 인한 단백질의 변성 때문일 수 있습니다. 4 °C에서 보관 된 피브로인 용액은 겔화 될 때까지 효과적으로 사용할 수 있으므로 피브로인 용액은 냉장 보관하고 겔화 후 다시 고치에서 정제하는 것이 좋습니다. 피브로인-AAV 용액은 3시간 미만 후에 발현이 불량하므로 최소 3시간 동안 건조해야 합니다. 마지막으로, 발현 영역은 사용 된 피브로인 -AAV 용액의 양에 따라 다릅니다. 도 3M의 예에서, 양은 작았다 (5 μL); 따라서 피브로인-AAV 필름은 창의 상반부만 덮어 창 위에 균일하지 않은 표현을 초래했습니다. 충분한 양의 피브로인 -AAV가 사용되면 전체 창에서 표현이 균일합니다.
기술의 수정
새로운 두개골 창 기술을 사용하면 동일한 마우스에서 피질 회로의 거시적 활동과 기본 단일 세포 수준 활동을 검사 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 다양한 신경 과학 연구에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 의사 결정 작업, 운동 학습 및 뇌 손상 및 질병의 마우스 모델에서 피질 활동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 또한이 방법이 설치류뿐만 아니라 인간이 아닌 영장류에도 적용될 수 있다고 믿습니다.
이 논문은 큰 두개골 창이 형질전환 마우스와 기능성 단백질을 발현하는 AAV를 주입한 마우스를 이미징하는 데 효과적임을 보여줍니다. 특히, 랩 상의 피브로인-AAV 필름은 피질의 넓은 영역에 걸쳐 GECI를 발현하는 것이 기존의 AAV 주입 방법보다 훨씬 쉽다는 것을 보여준다. 상이한 색상41의 GECI를 암호화하는 2 개의 AAV의 혼합물을 사용하여, 뉴런과 신경교 세포 활동 사이의 상관 관계는 피질의 넓은 영역에 걸쳐 동시에 이미징 될 수있다. 더욱이, 피브로인-AAV 막 방법은 다른 유전적으로 암호화된 바이오센서(42,43,44,45,46,47)에도 적용될 수 있다.
두 반구를 이미지화할 수 있는 더 큰 두개골 창도 가능합니다. 훨씬 더 넓은 시야 (~ 25 mm 2)를 가진2 광자 현미경이 최근25,26,27,28,29로 개발되었습니다. 이 2 광자 이미징 기술을 여기에 설명 된 넓은 두개골 창을 사용하여 1 광자 광시야 이미징과 결합하면 전례없는 규모에서 인구 활동과 단일 세포 활동 간의 관계를 조사 할 수 있습니다.
제한
식품 랩은 어떤 물질도 통과시키지 않습니다. 이로 인해이 방법을 약리학 실험에 사용하기가 어렵습니다. 랩을 제거하기가 어렵 기 때문에 유리 피펫이나 전극을 삽입 할 수 없습니다. 따라서 동시 칼슘 이미징 및 전기 생리 학적 기록, 유리 피펫을 사용한 약물의 국소 투여와 같은 다른 방법과 결합 된 실험을 구현하기가 어렵습니다. 이러한 제한에 대한 가능한 해결책은 구멍이있는 랩 및 유리창을 사용하는 것입니다. 이것은 유리 피펫 또는 기록 전극을 통해 뇌에 접근하는 것을 허용하면서 두개골 창을 장기간 멸균 상태로 유지합니다48.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 변형 연구 분야 (A) ‘Glial Decoding'(JP21H05621에서 SM으로), JSPS KAKENHI (JP19K06883에서 SM, 15KK0340에서 ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312에서 HB로, JP17H06313에서 KK), 질병 연구를위한 통합 신경 기술 (Brain / MINDS) (JP19dm0207079h0002에서 SM, JP19dm0207079에서 HB, JP19dm0207080에서 KK까지), Narishige Neuroscience Research Foundation (SM에게), 야마나시 현 (SM)과 다케다 과학 재단 (SM)의 젊은 연구원을위한 보조금과 야마나시 대학의 프론티어 뇌 연구 보조금이 부분적으로 지원합니다.
동물 관리 및 기술 지원을 해준 N. Yaguchi와 K. Okazaki, 그리고 유용한 토론을 해준 Kitamura 연구소 회원들에게 감사드립니다.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
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Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |