Flowcytometrianalyse av murine benmarg hematopoietiske stam- og stamceller og stromale nisjeceller
Summary
Her beskriver vi en enkel protokoll for isolering og farging av murine benmargceller til fenotype hemopoietiske stam- og stamceller sammen med de støttende nisjeendotel- og mesenkymale stamceller. En metode for å berike celler som ligger i endosteale og sentrale benmargsområder er også inkludert.
Abstract
Benmargen (BM) er det myke vevet som finnes i bein hvor hematopoiesis, prosessen der nye blodceller genereres, primært forekommer. Som sådan inneholder den hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs), samt støttende stromale celler som bidrar til vedlikehold og regulering av HSPCer. Hematologiske og andre BM-lidelser forstyrrer hematopoiesis ved å påvirke hematopoietiske celler direkte og / eller gjennom endring av BM-nisjen. Her beskriver vi en metode for å studere hematopoiesen ved helse og malignitet gjennom fenotypisk analyse av murine BM HSPCs og stromale nisjepopulasjoner ved flowcytometri. Vår metode beskriver de nødvendige trinnene for å berike BM-celler i endosteal og sentrale BM-fraksjoner, samt passende gatingstrategier for å identifisere de to viktige nisjecelletyper som er involvert i HSPC-regulering, endotelceller og mesenkymale stamceller. Den fenotypiske analysen som foreslås her, kan kombineres med musemutanter, sykdomsmodeller og funksjonelle analyser for å karakterisere HSPC-rommet og dets nisje.
Introduction
Flowcytometri er en uvurderlig metode for å karakterisere og prospektivt isolere immun- og hematopoietiske celler. Det blir også i økende grad brukt til å analysere stromale og epitelpopulasjoner av forskjellige vev. Den hematopoietiske stamcellen (HSC) har unike egenskaper av selvfornyelse og multipotens. Hos voksne pattedyr bor HSC primært i benmargen (BM), hvor de mottar ro- og overlevelsessignaler fra det omkringliggende mikromiljøet eller nisje1. HSC er formelt definert i henhold til funksjonsanalyser2. Likevel har flere banebrytende artikler vist nytten av flowcytometri for å identifisere HSC-er. Ved bruk av begrensede celleoverflatemarkører er det mulig å diskriminere hematopoietiske populasjoner som er svært beriket i HSCs3. Flowcytometri er derfor en sentral metode i stamcellefeltet. Det har blitt mye brukt til å evaluere virkningen av antatte nisjecelletyper og nisjefaktorer på HSC. Ved å kombinere flowcytometri med avbildning og funksjonelle analyser, har det vist seg at HSC støttes kritisk av perivaskulære mesenkymale stamceller (MSC) og endotelceller (EC). BM MSC er en heterogen gruppe og har forskjellige cytokinbidrag4, men det er veletablert at leptinreseptor (LepR) + MSC er viktige nisjeceller1. BM EC er også svært heterogen og kan være en del av sinusoider, arterioler og type H / overgangskar5. Ulike studier har vist det nyanserte bidraget fra disse ulike EC-ene. For eksempel er endosteal sinusformede EC romlig nærmere hvilende HSC6, mens ikke-migrerende HSC med lavere nivåer av reaktive oksygenarter ligger nær arteriolære ECs7. Den endosteal versus sentrale plasseringen av nisjer er også svært viktig. Endosteal type H-kar er assosiert med perivaskulære stromale celler som går tapt med aldring, noe som fører til tap av HSCs8. Ved akutt myelogen leukemi utvides sentrale e-KREFTER, mens endostealkar og endosteal HSC går tapt9.
De fleste studier på feltet har fokusert på selve hematopoiesen og på cellens ytre regulering av HSC. Det har imidlertid blitt stadig mer anerkjent at det er behov for å bedre karakterisere nisjene som regulerer andre forfedre, nemlig multipotente progenitorer (MPP), spesielt med tanke på at de er de viktigste driverne for hematopoiesis i steady state10. I motsetning til en fast hierarkisk struktur har nyere studier vist at hematopoiesis er et kontinuum der HSC skiller seg ut i partiske MPP på et tidlig stadium11. MPPer har blitt oppkalt etter forskjellige klassifikasjonssystemer12, men en nylig konsensusartikkel fra International Society for Experimental Hematology (ISEH) foreslo at MPPer skulle diskrimineres som tidlige MPPer og i henhold til deres lymfoide (MPP-Ly), megakaryocytiske og erytroide (MPP-Mk / E) og myeloide (MPP-G / M) bias13. Bruk av flowcytometri vil være avgjørende for videre studier av betydningen av BM-nisjer i reguleringen av disse populasjonene. Nåværende flowcytometrimetoder bruker variable gating-strategier for å differensiere HSPCer og identifisere stromale celler, nemlig ECs, ved hjelp av inkonsistente markører. Målet med den nåværende metoden er å presentere en enkel og reproduserbar arbeidsflyt for BM-farging for å identifisere HSPC-underpopulasjoner, heterogene grupper av EC og LepR + MSC. Vi tror at denne teknikken, selv om den er sammenlignbar med tidligere rapporterte metoder (se for eksempel referanse 14), gir en oppdatert og lett å implementere protokoll for fenotypisk analyse av hematopoietiske celler i de to funksjonelle margområdene, endosteal og sentral BM 8,15, samt BM stromale nisjeceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens protokollen beskrevet er enkel og lett å utføre, bør spesiell oppmerksomhet rettes mot bestemte trinn. For eksempel, når du oppnår skyllet BM (trinn 5.2), bør volumet eller antall ganger indikert for å passere PBS 2% FBS gjennom innsiden av den sentrale delen av benet ikke overskrides, da dette kan føre til betydelig kontaminering av den spylte prøven av endosteale cellepopulasjoner.
Endringer i protokollen kan gjøres for å lette utførelsen av etterforskeren. Ved prøveekstrak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM ble støttet av et stipend fra Lady Tata Memorial Trust. JR ble støttet av et doktorgradsstipend fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellesskap UI/BD/150833/2021). ML ble støttet av et PhD-stipend fra FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD ble støttet av tilskudd fra American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) og det portugisiske samfunnet for hematologi. Vi takker støtten fra Dr. Catarina Meireles og Emilia Cardoso fra TRACY-anlegget på i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
