Isolering og karakterisering af den naturlige mikrobiota af modellen Nematode Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans er en af de vigtigste modelarter inden for biologi, men næsten al forskning udføres i mangel af dets naturligt associerede mikrober. De metoder, der er beskrevet her, vil bidrage til at forbedre vores forståelse af mangfoldigheden af tilknyttede mikrober som grundlag for fremtidig funktionel C. elegans-forskning.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans interagerer med en stor mangfoldighed af mikroorganismer i naturen. Generelt findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg. Disse levesteder er rige på mikrober, der tjener som mad til C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået. Her beskriver vi en passende tilgang til isolering af C. elegans fra naturen og karakterisering af ormens mikrobiota. Nematoder kan let isoleres fra kompostmateriale, rådne æbler, snegle eller tiltrækkes ved at placere æbler på kompostbunker. Den bedste tid til at finde C. elegans på den nordlige halvkugle er fra september til november. Orme kan vaskes ud af opsamlet substratmateriale ved at nedsænke substratet i bufferopløsning efterfulgt af opsamling af nematoder og deres overførsel til nematodevækstmedium eller PCR-buffer til efterfølgende analyse. Vi illustrerer yderligere, hvordan prøverne kan bruges til at isolere og rense de ormassocierede mikroorganismer og til at behandle orme til 16S ribosomal RNA-analyse af mikrobiota-samfundssammensætning. Samlet set kan de beskrevne metoder stimulere ny forskning i karakteriseringen af C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer og derved bidrage til at opnå en omfattende forståelse af mangfoldigheden og stabiliteten af nematodens mikrobiota som grundlag for fremtidig funktionel forskning.

Introduction

I naturen findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker¹. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg ^2,3. Disse levesteder er rige på mikrober, som ikke kun tjener som mad til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Oplysninger om mangfoldigheden af naturligt associerede mikroorganismer blev først offentliggjort i 2016 ^4,5,6. Siden da har disse og kun få nyere undersøgelser afsløret, at C. elegans er forbundet med en række bakterier og svampe, oftest inklusive bakterier af slægten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormens tarm, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sandsynligvis være af afgørende betydning for vores forståelse af C. elegans biologi, fordi de kan give ernæring, beskytte mod patogener og muligvis andre stressfaktorer og påvirke centrale livshistorietræk såsom reproduktionshastighed, udvikling eller adfærdsmæssige reaktioner.

Som et eksempel kan naturligt associerede isolater af slægterne Pseudomonas, Ochrobactrum og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mod patogeninfektion og dræbe på forskellige måder 5,6,11,13,14. Et specifikt isolat af slægten Comamonas påvirker nematode kostrespons, udvikling, levetid og fertilitet^15,16,17. Providencia-bakterier producerer neuromodulatoren tyramin og modulerer derved værtsnervesystemets aktivitet og deraf følgende adfærdsmæssige reaktioner¹⁸. Et sæt forskellige naturligt associerede bakterier viste sig at påvirke befolkningstilvækst, fertilitet og adfærdsmæssige reaktioner 5,6,9,11,19.

Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået, og yderligere sammenhænge mellem ormen og mikrober fra dens miljø mangler stadig at blive afdækket. Flere tidligere undersøgelser anvendte bakteriestammer isoleret fra noget jordmiljø, naturlige C. elegans levesteder eller fra mesokosmoseksperimenter (dvs. laboratoriebaserede miljøer, der genskaber naturlige levesteder) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selvom disse undersøgelser opnåede ny indsigt i mikrobernes indflydelse på specifikke nematodeegenskaber (f.eks. Nematodemetabolisme²¹), er relevansen af disse interaktioner for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskript metoderne til direkte at isolere C. elegans fra naturen og til at isolere og efterfølgende karakterisere de naturligt associerede mikrober fra både enkelte orme og grupper af orme. De beskrevne metoder er en opdateret og forbedret version af de procedurer, der tidligere blev anvendt til isolering og karakterisering af naturlige C. elegans og dets oprindelige mikrobiota 2,6,7. I betragtning af at C. elegans i vid udstrækning findes i nedbrydning af plantemateriale over hele kloden (især i rådne frugter, tempererede regioner og om efteråret)1,2,22,23,24,25^, kan denne protokol anvendes af ethvert laboratorium, når der er interesse for at relatere C. elegans træk til naturligt associerede mikrober og dermed en mere naturligt relevant kontekst. Sidstnævnte er afgørende for en fuld forståelse af nematodens biologi, fordi det er kendt fra en mangfoldighed af andre værtssystemer, at den tilknyttede mikrobiota kan påvirke forskellige livshistoriekarakteristika²⁶, et aspekt, der i øjeblikket stort set overses i de mange C. elegans-undersøgelser på tværs af næsten alle biovidenskabelige discipliner.

Protocol

1. Forberedelse af buffere og medier Forbered S-buffer ved at tilsætte 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO 4,5,926 g KH2PO4 og 1 liter deioniseret H2O, til en kolbe og autoklave i 20 minutter ved 121 °C. Forbered et tyktflydende medium ved at tilsætte S-buffer indeholdende 1,2% (w / v) hydroxymethylcellulose (stoffet, der forårsager viskositet af mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v /…

Representative Results

Nematoden C. elegans findes ofte i nedbrydende frugter, såsom æbler, og også kompostprøver. I Nordtyskland findes C. elegans såvel som congeneriske arter (især C. remanei, men også C. briggsae) hovedsageligt fra september til2. november. Nematoderne findes oftest i nedbrydende plantemateriale, især rådne frugter som æbler eller pærer, og også kompost, især materiale, der viser en høj nedbrydningskvalitet. Frugt- og kompostprøverne kan tages ind i …

Discussion

Nematoden Caenorhabditis elegans er en af de mest intensivt studerede modelorganismer inden for biologisk forskning. Det blev introduceret af Sydney Brenner i 1960’erne, oprindeligt for at forstå nervesystemets udvikling og funktion²⁹. Siden da er C. elegans blevet en stærk model til at studere grundlæggende processer på tværs af alle biologiske discipliner, herunder adfærdsbiologi, neurobiologi, aldring, evolutionær biologi, cellebiologi, udviklingsbiologi og immunologi. …

Materials

COMSOL

COMSOL

multiphysics simulation software