Isolering og karakterisering av den naturlige mikrobiotaen til modellen Nematode Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans er en av de viktigste modellartene i biologi, men nesten all forskning utføres i fravær av dens naturlig assosierte mikrober. Metodene beskrevet her vil bidra til å forbedre vår forståelse av mangfoldet av tilknyttede mikrober som grunnlag for fremtidig funksjonell C. elegans forskning.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans samhandler med et stort mangfold av mikroorganismer i naturen. Generelt er C. elegans ofte funnet i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger. Det er også forbundet med visse hvirvelløse verter som snegler og woodlice. Disse habitatene er rike på mikrober, som tjener som mat for C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått. Her beskriver vi en passende tilnærming for å isolere C. elegans fra naturen og karakterisere mikrobiota av ormer. Nematoder kan lett isoleres fra kompostmateriale, råtnende epler, snegler eller tiltrekkes ved å plassere epler på komposthauger. Den beste tiden for å finne C. elegans på den nordlige halvkule er fra september til november. Ormer kan vaskes ut av oppsamlet substratmateriale ved å nedsenke substratet i bufferløsning, etterfulgt av innsamling av nematoder og overføring til nematodevekstmedium eller PCR-buffer for etterfølgende analyse. Vi illustrerer videre hvordan prøvene kan brukes til å isolere og rense ormassosierte mikroorganismer og til å behandle ormer for 16S ribosomal RNA-analyse av mikrobiotasamfunnssammensetning. Samlet sett kan de beskrevne metodene stimulere til ny forskning på karakterisering av C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder, og dermed bidra til å oppnå en omfattende forståelse av mangfoldet og stabiliteten til nematodens mikrobiota som grunnlag for fremtidig funksjonell forskning.

Introduction

I naturen finnes C. elegans ofte i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger¹. Det er også forbundet med visse virvelløse verter som snegler og woodlice ^2,3. Disse habitatene er rike på mikrober, som ikke bare tjener som mat til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Informasjon om mangfoldet av naturlig assosierte mikroorganismer ble først publisert i 2016 ^4,5,6. Siden da har disse og bare noen få nyere studier vist at C. elegans er assosiert med en rekke bakterier og sopp, oftest inkludert bakterier av slekten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormtarmen, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sannsynligvis være av sentral betydning for vår forståelse av C. elegans biologi fordi de kan gi ernæring, beskytte mot patogener og muligens andre stressorer, og påvirke sentrale livshistorieegenskaper som reproduktiv hastighet, utvikling eller atferdsrespons.

Som et eksempel kan naturlig assosierte isolater av slektene Pseudomonas, Ochrobactrum, og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mot patogeninfeksjon og drepe på forskjellige måter 5,6,11,13,14. Et spesifikt isolat av slekten Comamonas påvirker nematode kostholdsrespons, utvikling, levetid og fruktbarhet^15,16,17. Providencia-bakterier produserer nevromodulatoren tyramin og derved modulerer vertsnervesystemets aktivitet og resulterende atferdsresponser¹⁸. Et sett med forskjellige naturlig assosierte bakterier ble vist å påvirke befolkningsvekst, fruktbarhet og atferdsrespons 5,6,9,11,19.

Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått, og ytterligere foreninger mellom ormen og mikrober fra miljøet gjenstår å bli avdekket. Flere tidligere studier brukte bakteriestammer isolert fra noe jordmiljø, naturlige C. elegans habitater, eller fra mesokosmeksperimenter (dvs. laboratoriebaserte miljøer som gjenskaper naturlige habitater) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selv om disse studiene fikk ny innsikt i påvirkning av mikrober på spesifikke nematodeegenskaper (f.eks. Nematodemetabolisme²¹), er relevansen av disse interaksjonene for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskriptet metodene for å direkte isolere C. elegans fra naturen og å isolere og deretter karakterisere de naturlig assosierte mikrober fra både enkeltormer og grupper av ormer. De beskrevne metodene er en oppdatert og forbedret versjon av prosedyrene som tidligere ble brukt for isolering og karakterisering av naturlige C. elegans og dens opprinnelige mikrobiota 2,6,7. Tatt i betraktning at C. elegans er utbredt i nedbrytende plantemateriale over hele verden (spesielt i råtnende frukt, tempererte områder og om høsten)1,2,22,23,24,25^, kan denne protokollen brukes av ethvert laboratorium når det er interesse for å relatere C. elegans egenskaper til naturlig assosierte mikrober og dermed en mer naturlig relevant kontekst. Sistnevnte er avgjørende for en full forståelse av nematodens biologi fordi det er kjent fra et mangfold av andre vertssystemer at den tilhørende mikrobiotaen kan påvirke ulike livshistorieegenskaper²⁶, et aspekt som for tiden i stor grad er neglisjert i mangfoldet av C. elegans-studier på tvers av nesten alle livsvitenskapsdisipliner.

Protocol

1. Forberedelse av buffere og medier Forbered S-buffer ved å tilsette 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO4, 5,926 g KH2PO4 og 1 L avionisertH2O til en kolbe og autoklav i 20 minutter ved 121 °C. Forbered et viskøst medium ved å tilsette S-buffer som inneholder 1,2% (w / v) hydroksymetylcellulose (stoffet som forårsaker viskositet i mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v / v) aceton. Au…

Representative Results

Nematoden C. elegans finnes ofte i nedbrytende frukt, som epler, og også kompostprøver. I Nord-Tyskland finnes C. elegans samt congeneric arter (spesielt C. remanei, men også C. briggsae) hovedsakelig fra september til2. november. Nematoder er oftest funnet i nedbrytende plantemateriale, spesielt råtnende frukter som epler eller pærer, og også kompost, spesielt materiale som viser en høy grad av nedbrytning. Frukt- og kompostprøvene kan tas inn i laborat…

Discussion

Nematoden Caenorhabditis elegans er en av de mest intensivt studerte modellorganismene i biologisk forskning. Det ble introdusert av Sydney Brenner på 1960-tallet, opprinnelig for å forstå utviklingen og funksjonen til nervesystemet²⁹. Siden da har C. elegans blitt en kraftig modell for å studere grunnleggende prosesser på tvers av alle biologiske disipliner, inkludert atferdsbiologi, nevrobiologi, aldring, evolusjonær biologi, cellebiologi, utviklingsbiologi og immunologi….

Materials

COMSOL

COMSOL

multiphysics simulation software