عزل وقياس فيروس إبشتاين بار من خط الخلية P3HR1
Summary
يسمح هذا البروتوكول بعزل جزيئات فيروس إبشتاين بار من خط خلايا P3HR1 البشري عند تحفيز الدورة الفيروسية مع phorbol 12-myristate 13-acetate. يتم استخراج الحمض النووي لاحقا من المستحضر الفيروسي وإخضاعه لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد تركيز الجسيمات الفيروسية.
Abstract
فيروس إبشتاين بار (EBV) ، المعين رسميا باسم فيروس الهربس البشري 4 (HHV-4) ، هو أول فيروس ورم بشري معزول. ما يقرب من 90-95 ٪ من السكان البالغين في العالم مصابون بفيروس EBV. مع التطورات الحديثة في البيولوجيا الجزيئية وعلم المناعة ، قدم تطبيق كل من النماذج التجريبية في المختبر وفي الجسم الحي نظرة عميقة وذات مغزى حول التسبب في EBV في العديد من الأمراض وكذلك في تكوين الأورام المرتبطة ب EBV. الهدف من ورقة التجربة المرئية هذه هو تقديم نظرة عامة على عزل جزيئات EBV الفيروسية من خلايا خط الخلايا P3HR1 ، متبوعا بتقدير كمي للتحضير الفيروسي. يمكن لخلايا P3HR1 ، المعزولة في الأصل من سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت البشري ، أن تنتج فيروس P3HR1 ، وهو سلالة EBV من النوع 2. يمكن تحفيز الدورة lytic EBV في خلايا P3HR1 هذه عن طريق العلاج باستخدام phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ، مما ينتج عنه جزيئات فيروسية EBV.
باستخدام هذا البروتوكول لعزل جزيئات EBV ، يتم استزراع خلايا P3HR1 لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في وسط RPMI-1640 كامل يحتوي على 35 نانوغرام / مل PMA. بعد ذلك ، يتم طرد وسط الاستزراع بسرعة 120 × جم لمدة 8 دقائق لتكوير الخلايا. ثم يتم جمع المادة الطافية المحتوية على الفيروس وتدويرها بسرعة 16000 × جم لمدة 90 دقيقة لتكوير جزيئات EBV. ثم يتم إعادة تعليق الحبيبات الفيروسية في وسط RPMI-1640 كامل. ويتبع ذلك استخراج الحمض النووي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي لتقييم تركيز جزيئات EBV في التحضير.
Introduction
فيروس إبشتاين بار (EBV) هو أول فيروس ورم بشري يتم عزله1. EBV ، الذي يشار إليه رسميا باسم فيروس الهربس البشري 4 (HHV-4) 2 ، هو جزء من فصيلة فيروس الهربس غاما من عائلة فيروس الهربس وهو النموذج الأولي لجنس Lymphocryptovirus. ما يقرب من 90-95 ٪ من السكان البالغين في العالم مصابون بالفيروس3. في معظم الحالات ، تحدث العدوى الأولية خلال أول 3 سنوات من الحياة وتكون بدون أعراض ، ومع ذلك ، إذا حدثت العدوى في وقت لاحق خلال فترة المراهقة ، فقد تؤدي إلى مرض يشار إليه باسم كريات الدم البيضاء المعدية4. EBV قادر على إصابة الخلايا البائية المستريحة مما يحثها على أن تصبح أرومات لمفاوية B تكاثرية حيث يؤسس الفيروس ويحافظ على حالة إصابة كامنة5. يمكن إعادة تنشيط EBV في أي وقت وبالتالي يؤدي إلى التهابات متكررة6.
على مدى السنوات ال 50 الماضية ، أصبح الارتباط بين بعض الفيروسات وتطور الأورام الخبيثة البشرية واضحا بشكل متزايد ، واليوم تشير التقديرات إلى أن 15٪ إلى 20٪ من جميع أنواع السرطان البشرية مرتبطة بالعدوى الفيروسية7. فيروسات الهربس ، بما في ذلك EBV ، هي بعض من أفضل الأمثلة المدروسة لهذه الأنواع من فيروسات الورم8. في الواقع ، يمكن أن يسبب EBV العديد من أنواع الأورام الخبيثة البشرية ، مثل سرطان الغدد الليمفاوية Burkitt (BL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية هودجكين (HL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة ، وأمراض التكاثر اللمفاوي في المضيفين الذين يعانون من نقص المناعة 9,10. كما ثبت أن EBV مرتبط بتطور أمراض المناعة الذاتية الجهازية. بعض الأمثلة على اضطرابات المناعة الذاتية هذه هي التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) ، التهاب العضلات – التهاب الجلد والعضلات (PM-DM) ، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، مرض النسيج الضام المختلط (MCTD) ، ومتلازمة سجوجرن (SS) 11. يرتبط EBV أيضا بتطور مرض التهاب الأمعاء (IBD)12.
يمكن دراسة العديد من هذه الأمراض أو نمذجتها باستخدام زراعة الخلايا أو الفئران أو الكائنات الحية الأخرى المصابة بفيروس EBV. هذا هو السبب في أن جزيئات EBV ضرورية لإصابة الخلايا أو الكائنات الحية ، سواء في المختبر أو في نماذج الجسم الحي 13،14،15،16 ، ومن هنا تأتي الحاجة إلى تطوير تقنية تسمح بعزل الجسيمات الفيروسية بتكلفة منخفضة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا إرشادات لطريقة سهلة لعزل جزيئات EBV بشكل موثوق من خط خلية يمكن الوصول إليه نسبيا وتحديد كمية الجسيمات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، وهو فعال من حيث التكلفة ومتاح بسهولة لمعظم المختبرات. هذا بالمقارنة مع العديد من الطرق الأخرى التي تم وصفها لعزل EBV من خطوط الخلايا المختلفة17،18،19،20.
P3HR-1 هو خط خلية BL ينمو معلقا ويصاب بشكل كامن بسلالة EBV من النوع 2. هذا الخط الخلوي هو منتج EBV ويمكن تحريضه لإنتاج جزيئات فيروسية. الهدف من هذه المخطوطة هو عرض طريقة تسمح بعزل جزيئات EBV من خط الخلية P3HR-1 ، يليها تحديد كمية المخزون الفيروسي الذي يمكن استخدامه لاحقا لكل من النماذج التجريبية في المختبر وفي الجسم الحي .
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد إنتاج جزيئات EBV ضروريا لفهم بيولوجيا هذا الفيروس وكذلك الأمراض المرتبطة به. وصفنا هنا إنتاج هذه الجسيمات من خط الخلية P3HR-1. خط الخلية هذا ليس خط المنتج الوحيد ل EBV. في الواقع ، تم أيضا عزل جزيئات EBV من خلايا B95-821,22 وكذلك خط خلايا Raji18,19</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم تمويل هذا العمل من خلال منح لقسم الطوارئ من صندوق الأسمر للأبحاث والمجلس الوطني اللبناني للبحوث العلمية (L-CNRS) وخطة الممارسة الطبية (MPP) في الجامعة الأمريكية في بيروت.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E., Schwab, M. . Encyclopedia of Cancer. , 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
