इन विट्रो नैनोइमल्शन वैक्सीन एडजुवेंट ओफिओपोगोनिन डी का सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन
Summary
प्रोटोकॉल मूल्यांकन के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है कि क्या नैनोइमल्शन ओफिओपोगोनिन डी सहायक प्रभावी सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है।
Abstract
टीकों के एक प्रमुख घटक के रूप में, सहायक सीधे एंटीजन से जुड़े शक्तिशाली, व्यापक, जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित या बढ़ा सकते हैं। ओफिओपोगोन डी (ओपी-डी), पौधे ओफिओपोगोन जैपोनिकस से निकाला गया एक शुद्ध घटक, वैक्सीन सहायक के रूप में उपयोगी पाया गया है। ओपी-डी की कम घुलनशीलता और विषाक्तता की समस्याओं को नैनोइमल्शन ओफिओपोगोनिन डी (एनओडी) तैयार करने के लिए कम ऊर्जा वाले पायसीकरण विधि का उपयोग करके प्रभावी ढंग से दूर किया जा सकता है। इस लेख में, सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला की जांच की जाती है। एल 929 के साइटोटोक्सिक प्रभाव ों को सेल काउंटिंग किट -8 परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। फिर, प्रतिरक्षित चूहों से स्प्लेनोसाइट्स की उत्तेजना और संस्कृति के बाद स्रावित साइटोकिन स्तर और संबंधित प्रतिरक्षा कोशिका संख्या का पता एलिसा और ईएलआईस्पॉट विधियों द्वारा लगाया गया था। इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) में एंटीजन अपटेक क्षमता, जो सी 57बीएल / 6 चूहों से अलग थी और जीएम-सीएसएफ प्लस आईएल -4 के साथ इनक्यूबेशन के बाद परिपक्व हुई थी, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा देखी गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, मैक्रोफेज सक्रियण की पुष्टि आईएल -1, आईएल -6, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ -α) साइटोकिन्स के स्तर को एलिसा किट द्वारा 24 घंटे के लिए सहायक के साथ खाली चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) को जोड़ने के बाद की गई थी। यह आशा की जाती है कि यह प्रोटोकॉल अन्य शोधकर्ताओं को नए वैक्सीन सहायक दवाओं की सेलुलर प्रतिक्रिया प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्यक्ष और प्रभावी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करेगा।
Introduction
टीके संक्रामक और गैर-संचारी रोगों को रोकने और उनका इलाज करने का एक महत्वपूर्ण साधन हैं। वैक्सीन फॉर्मूलेशन में सहायक और वितरण वाहनों का उचित जोड़ एंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने और लंबे समय तक चलने वालीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने के लिए फायदेमंद है। शास्त्रीय सहायक फिटकरी (एल्यूमीनियम नमक) के अलावा, टीकों के लिए छह प्रकार के सहायक हैं जो वर्तमान में विपणन किए जाते हैं: एमएफ 59 2,3,एएस04 3,एएस03 3,एएस01 3, सीपीजी 10184, और मैट्रिक्स-एम5। आम तौर पर, जब मानव शरीर एक वायरल हमले का सामना करता है, तो रक्षा की पहली और दूसरी लाइनें (त्वचा, म्यूकोसा और मैक्रोफेज) वायरस को साफ करने में अग्रणी होती हैं, और अंत में, प्रतिरक्षा अंगों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल करने वाली रक्षा की तीसरी पंक्ति सक्रिय होती है। एल्यूमीनियम और एल्यूमीनियम लवण 1920 के दशक की शुरुआत से मानव टीकों के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले सहायक रहे हैं, जो एक प्रभावी जन्मजातप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं। हालांकि, यह प्रस्तावित किया गया है कि शास्त्रीय सहायक द्वारा एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) की सक्रियता, जो साइटोकिन्स और केमोकाइन के विशिष्ट सेट उत्पन्न करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को उत्तेजित करती है, वह तंत्र है जिसके द्वारा सहायक काम करते हैं और यह एक कारण हो सकता है कि सहायक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर केवल क्षणिक प्रभावडालते हैं। मानव उपयोग के लिए सीमित लाइसेंस प्राप्त सहायक दवाओं की उपस्थिति टीकों को विकसित करने के लिए एक प्रतिबंधात्मक कारक है जो प्रभावीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हैं।
वर्तमान में, सहायक अध्ययनों की बढ़ती संख्या चूहों में एक मजबूत सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने की क्षमता का प्रदर्शन कर रही है। क्यूएस -21 को एक संतुलित टी-हेल्पर 1 (टीएच 1) और टी-हेल्पर 2 (टीएच 2) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने, एंटीबॉडी टिटर्स के उच्च स्तर का उत्पादन करने और एक सहायक के रूप में सुरक्षा को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इसकी मजबूत विषाक्तता और हेमोलिटिक गुण एक स्टैंडअलोन नैदानिक सहायक 9,10 के रूप में इसके विकास को सीमित करते हैं। ओपी-डी (रुस्कोजेनिन-ओ-α-एल-रेहम्नोपाइरानोसी 1-(1→2)-β-डी-जाइलोपाइरानोसाइल-(1→3)-β-डी-फ्यूकोपायरानोसाइड) चीनी औषधीय पौधे ओफिओपोगोन जैपोनिकास4 की जड़ से पृथक स्टेरायडल सैपोनिन में से एक है। इसके अतिरिक्त, यह मूलांक ओफिओपोगोनिस में पाया जाने वाला मुख्य औषधीय रूप से सक्रिय घटक (शेन माई सैन) है औरइसमें कुछ औषधीय गुण हैं। इसके अलावा, यह लिलियासी परिवार का एक सदस्य है और सेलुलर सूजन और मायोकार्डियल चोट में इसके निरोधात्मक और सुरक्षात्मक प्रभावों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, ओपी-डी बीएएलबी /सी चूहों में डीएनएसीबी-प्रेरित एटोपिक जिल्द की सूजन जैसे घावों और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ -α) भड़काऊ एचसीएटी कोशिकाओं को सुधारता है। महत्वपूर्ण रूप से, ओपी-डी कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम के एंटीऑक्सिडेटिव संरक्षण को बढ़ावा देता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी को कम करके और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति को बाधित करके डॉक्सोर्यूबिसिन-प्रेरित ऑटोफैजिक चोट के खिलाफ दिल की रक्षा करता है। प्रयोगों से पता चला है कि मोनो-डेस्मोसाइड के साथ ओपी-डी लेने से प्रतिरक्षा स्वास्थ्य को बढ़ावा देने, सफेद रक्त कोशिका की गिनती और डीएनए संश्लेषण में वृद्धि करने और एंटीबॉडी को लंबे समय तक बनाने में मदद मिलतीहै। यह पहले पाया गया है कि ओपी-डी का एक सहायक प्रभाव14 है।
नैनोइमल्शन तेल-इन-वाटर नैनोफॉर्मुलेशन हैं जो सर्फेक्टेंट, तेल, कोसर्फेक्टेंट्स और पानी12,15 के संयोजन से बने होते हैं। ये नैनोवैक्सीन डिज़ाइन एंटीजन और सहायक को प्रतिरक्षा उत्तेजना को बढ़ाने, एंटीजन की रक्षा करने और डेंड्राइटिक सेल (डीसी) परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए एक साथ समझाया जासकता है। स्क्रीनिंग से प्राप्त इन नवीन सहायक दवाओं के विकास के लिए, उनकी सेलुलर प्रतिक्रिया क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए उचित तरीके खोजना महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना है कि क्या सहायक इन विट्रो सेल संस्कृति में फागोसाइटोसिस और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं और मुख्य प्रयोगात्मक तरीकों पर विस्तृत कर सकते हैं। प्रयोग को चार उपखंडों में विभाजित किया गया है: (1) एल 929 कोशिकाओं के लिए ओपी-डी और एनओडी की विषाक्तता सेल काउंटिंग किट -8 (सीसीके -8) परख द्वारा निर्धारित की जाती है; (2) अंतःस्रावी आईएफएन -γ और आईएल -17 ए के साइटोकिन स्तर और प्रतिरक्षित चूहों में संबंधित सेल संख्या स्प्लेनोसाइट उत्तेजना और ईएलआईस्पॉट परख द्वारा पता लगाया जाता है; (3) सहायक उत्तेजना के बाद डीसी की एंटीजन प्रस्तुति क्षमता को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जाता है; और (4) सामान्य चूहों में पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) से प्राप्त सुपरनैटेंट में तीन प्रकार के साइटोकिन्स, आईएल -1, आईएल -6, और टीएनएफ -α का पता लगाया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबयूनिट टीके उत्कृष्ट सुरक्षा प्रदान करते हैं लेकिन खराब इम्युनोजेनेसिटी प्रदान करते हैं। इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने की मुख्य रणनीति सहायक दवाओं के साथ एंटीजन को शारीरिक रूप से सोखना या जोड़ना है औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम के अनुदान संख्या 2021वाईएफसी 2302603, अनुदान संख्या 31670938, 32070924, 82041045 और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन कार्यक्रम के 32000651 द्वारा समर्थित किया गया था। आर्मी मेडिकल यूनिवर्सिटी की विशेष परियोजनाओं के अनुदान संख्या 2020एक्सबीके 24, और कॉलेज के छात्रों के लिए राष्ट्रीय नवाचार और उद्यमिता कार्यक्रम के अनुदान संख्या 202090031021।
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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