Summary
Denne protokol beskriver syntesen af cykliske cellepenetrerende peptider med aromatiske tværbindinger og evalueringen af deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer.
Abstract
Kræft har været en stor udfordring i den globale sundhed. Imidlertid begrænser det komplekse tumormikromiljø generelt adgangen til terapi til dybere tumorceller, hvilket fører til tumorgentagelse. For at overvinde den begrænsede penetration af biologiske barrierer er cellepenetrerende peptider (CPP'er) blevet opdaget med fremragende membrantranslokationsevne og har vist sig som nyttige molekylære transportører til levering af forskellige laster i celler. Imidlertid viser konventionelle lineære CPP'er generelt kompromitteret proteolytisk stabilitet, hvilket begrænser deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer. Udviklingen af nye molekylære transportører, der kan trænge igennem biologiske barrierer og udvise forbedret proteolytisk stabilitet, er således meget ønsket for at fremme lægemiddelleveringseffektivitet i biomedicinske applikationer. Vi har tidligere syntetiseret et panel af korte cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger, som udviste overlegen permeabilitet i kræftceller og væv sammenlignet med deres lineære modstykker. Her beskrives en kortfattet protokol til syntese af det fluorescerende mærkede cykliske polyarginin R8-peptid og dets lineære modstykke samt nøgletrin til undersøgelse af deres cellepermeabilitet.
Introduction
De sidste par årtier har været vidne til hurtige fremskridt i udviklingen af cellepenetrerende peptider (CPP'er) til lægemiddelafgivelse. CPP'er er blevet anvendt i vid udstrækning som molekylære transportører til behandling af en række livstruende sygdomme, herunder neurologiske lidelser1,2, hjertesygdomme3, diabetes4, dermatose5 og kræft 6,7. Kræft er fortsat en global sundhedsbyrde ledsaget af en høj sygelighed og dødelighed på trods af en omfattende forskningsindsats8. En alvorlig hindring for behandling af kræft er den begrænsede adgang til terapi til dybere tumorceller på grund af fysiologiske barrierer såsom kompakt ekstracellulær matrix (ECM), unormal tumorvaskulatur, flere membranbarrierer og højt interstitielt væsketryk (IFP)9. Udvikling af nye CPP'er med overlegen evne til at levere last på tværs af biologiske barrierer betragtes således som en væsentlig strategi for kræftbehandling10,11.
CPP'er kan kategoriseres i kationiske, amfipatiske og hydrofobe CPP'er med hensyn til deres fysisk-kemiske egenskaber12. Blandt disse er det positivt ladede HIV-TAT-peptid og det syntetiske polyarginin af stor betydning i biomedicinsk forskning og er blevet grundigt undersøgt for at lette intracellulær lægemiddelafgivelse13. Tunnemann et al. rapporterede, at en minimumslængde på otte argininer er afgørende for effektiv cellepenetration af de syntetiske polyargininpeptider, baseret på en cellepermeabilitetsundersøgelse udført under anvendelse af R3 til R12 peptider14. Imidlertid har disse CPP'er generelt korte plasmahalveringstider på grund af deres hurtige hydrolyse in vivo. Derudover er der lidt kendt om optimering af den kemiske struktur af CPP'er for at øge deres transbarriereevne, da det er udfordrende at trænge ind i flere cellemembraner15. Udviklingen af nye molekylære transportører, der er i stand til at trænge igennem biologiske barrierer, er således stærkt ønsket for at forbedre lægemiddelleveringseffektiviteten. I 2020 opdagede Komin et al.16 en CPP kaldet CL-peptid, som indeholder et helixmotiv (RLLRLLR) og en polyargininhale (R7) til krydsning af epitelmonolaget. Et sæt CL-peptidvarianter blev også syntetiseret ved at ændre det spiralformede mønster. Denne undersøgelse kunne være en vigtig rettesnor for udviklingen af nye CPP'er til levering af last på tværs af biologiske barrierer. Desuden optimerede Dietrich et al. cellepermeabiliteten af StAX-peptidet og hæmmede Wnt/β-catenin-signalvejen ved at øge peptidernes samlede hydrofobicitet17.
Konformationsbegrænsning af ustrukturerede lineære peptider ved cyklisering er en effektiv måde at forbedre deres proteolytiske stabilitet og permeabilitet18,19,20. Den strukturelle forstærkning øger proteaseresistensen af cykliske peptider, hvilket gør dem mere stabile in vivo sammenlignet med deres lineære modstykker. Derudover kan cykliseringen af peptider potentielt maskere den polære peptidrygrad ved at fremme intramolekylær hydrogenbinding og dermed øge peptidernes membranpermeabilitet21. I de sidste to årtier er kemoselektive cykliseringsmetoder blevet effektive strategier til konstruktion af cykliske peptider med forskellige arkitekturer, såsom carbonhydrid, lactam, triazol, m-xylen, perfluoraryl og andre tværbindinger22,23. Den biologiske barriere, der pålægges af det sofistikerede tumormikromiljø, kan reducere penetrationen af lægemidler i faste tumorer24. Vi har tidligere fundet, at de cykliske CPP'er viste overlegen modstand mod enzymatisk fordøjelse i forhold til deres lineære modstykker20. Desuden er peptidernes samlede hydrofobicitet afgørende for deres forbedrede cellepermeabilitet22. Baseret på de ovenfor diskuterede undersøgelser kan kombinationen af et positivt ladet mønster, forhøjet samlet hydrofobicitet og forbedret proteolysestabilitet antages at øge permeabiliteten af CPP'er på tværs af biologiske barrierer. I en nylig undersøgelse identificerede vi to cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger på positionerne i og i + 7, der udviser forbedret permeabilitet i tumorceller og væv sammenlignet med deres lineære modstykker15. Her præsenteres en kortfattet syntetisk protokol til syntese af fluorescerende mærkede cykliske CPP'er og de vigtigste trin til at undersøge deres permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af udstyr
BEMÆRK: Udfør alle procedurer i en fungerende stinkhætte med passende personlige værnemidler.
- Det manuelle peptidsynteseapparat samles i stinkhætten (figur 1). Trevejs stophanerne (se Materialetabel) anbringes på vakuummanifolden (se Materialetabel) og forbindes til nitrogenet (N2). Sørg for at begrænse de ubrugte indtag.
- Fastgør en 10 ml polypropylensøjle (se materialetabel) på trevejs stophanerne. Reaktionsblandingen eller opløsningsmidlerne tømmes fra polypropylensøjlen ved hjælp af en gummipipettepære eller et vakuum via en affaldsfælde.
2. Syntese af FITC-mærket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-mærket hæftet R8-peptid (FITC-sR8-4)
BEMÆRK: Peptiderne blev syntetiseret i henhold til en standard Fmoc-baseret fastfasepeptidsyntese (SPPS) protokol25. 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-harpiks (rinkamid MBHA-harpiks, se materialetabel) blev anvendt i hele undersøgelsen.
FORSIGTIG: N, N-dimethylformamid (DMF), N, N-diisopropylethylamin (DIPEA), morpholin og dichlormethan (DCM) er alle farveløse og er skadelige, hvis de indåndes eller absorberes gennem huden. Ether er ekstremt brandfarlig. 1,2-Ethanedithiol (EDT) er et særligt lugtende stof. Trifluoreddikesyre (TFA) er stærkt ætsende, og dens surhedsgrad er 105 gange eddikesyre. Derfor skal alle reagenser og kemikalier håndteres ved hjælp af beskyttelsesudstyr i en stinkhætte.
- Forbered harpiksen til peptidsyntese.
- Beregn massen af harpiks, der er nødvendig til syntesen:Masse harpiks (mg) = skala (mmol) / harpiksbelastningskapacitet (mmol / g) × 1.000 (mg / g)
BEMÆRK: For eksempel er massen af rinkamid MBHA-harpiks (0,572 mmol / g) for 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / g × 1.000 mg / g = 350 mg. - Tilsæt 4-5 ml DMF til den nødvendige mængde harpiks og overfør til 10 ml polypropylensøjlen (trin 1.2) med blidN2-boblende i 30 minutter for at svulme harpiksen tilstrækkeligt op, og tøm derefter DMF'en.
- Tilsæt 4-5 ml 50% morpholin/DMF (v/v) til harpiksen, boble forsigtigt N2 i 30 min 2x for at fjerne den N-terminale Fmoc-gruppe, og dræn derefter blandingen. Derefter vaskes harpiksen grundigt 3x ved at tilsætte 4-5 ml DMF til søjlen og boble med N2 i mindst 1 min hver gang. Fortsæt med at vaske harpiksen med DCM (3x) og DMF (3x) på samme måde.
- Beregn massen af harpiks, der er nødvendig til syntesen:Masse harpiks (mg) = skala (mmol) / harpiksbelastningskapacitet (mmol / g) × 1.000 (mg / g)
- Udfør Fmoc-beskyttet aminosyrekobling som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Koblingen af arginin i en 0,2 mmol skala manuel syntese er beskrevet her som et eksempel.- Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 ækvivalent, 648,8 mg) og 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU, 4,9 ækvivalent, 372,6 mg) opløses i 5 ml DMF i et centrifugeglas.
- DIPEA (10 ækvivalent, 348,4 μL) tilsættes for at aktivere koblingsreaktionen, og reaktionsblandingen overføres derefter til 10 ml polypropylensøjlen med harpiks (fremstillet i trin 2.1.3). Derefter omrystes blandingen forsigtigt medN2 boblende i 1-2 timer.
- Koblingsreaktionen (trin 2.2.1 og 2.2.2) gentages én gang.
- Efter afslutning af koblingen tømmes reaktionsblandingen, og harpiksen vaskes sekventielt med DMF, DCM og DMF 3x hver i mindst 1 min hver gang.
- Udfør kobling af hver aminosyre i ordnede trin: Der tilsættes 4-5 ml 50% morpholin/DMF (v/v) til harpiksen, bobles forsigtigt med N 2 i 30 min 2x for at fjerne N-α-Fmoc-gruppen, vask derefter harpiksen (som vist i trin 2.2.4), og fortsæt med at koble den næste aminosyre (som vist i trin 2.2.1 og trin 2.2.2). Fortsæt med flere cyklusser af dette trin for at opnå syntese af det ønskede peptid.
BEMÆRK: Denne proces kan sættes på pause her. Kondenser harpiksen med methanol og tør harpiksen med en kontinuerlig strøm afN2. Hætte polypropylensøjlen, og opbevar derefter harpiksen ved 4 ° C i et par dage (eller ved -20 ° C ved længere opbevaring). Svulme harpiksen med 4-5 ml DMF i 0,5-1 time, før du starter en ny syntese. Hvis du går direkte videre til næste trin, er det ikke nødvendigt at kondensere harpiksen.
- Mærk peptiderne med fluoresceinisothiocyanat (FITC) som beskrevet nedenfor.
- Par beta-alanin som afstandsstykke til FITC-mærkning ved hjælp af den samme proces som anvendt til aminosyrekobling i trin 2.2.
- Udfør FITC-mærkning af peptider på harpiksen ved at tilsætte en blanding af FITC (5 ækvivalent), DIPEA (10 ækvivalent) og DMF til polypropylensøjlen og reagere i mørke i 8 timer.
- Til syntese af FITC-sR8-4 udføres cyklisering af det lineære peptid som beskrevet nedenfor.
- Der tilsættes en blanding af TFA/triisopropylsilan (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) til polypropylensøjlen i 2 minutter for selektivt at fjerne Cys (Trt)-beskyttelsesgruppen, og derefter drænes blandingen. Gentag ovenstående procedure, indtil den gullige opløsning bliver farveløs for helt at fjerne Trt-beskyttelsesgruppen.
- Udfør derefter sekventielle vaske af harpiksen med DMF og DCM mindst 3x. Derefter opløses 4,4'-bis(brommethyl)biphenyl (2 ækvivalent) i DMF med DIPEA (4 ækvivalent), tilsættes til kolonnen og reagerer i 4 timer.
- Spaltning peptiderne som beskrevet: Efter afslutningen af peptidsyntese vaskes harpiksen med 4-5 ml methanol to gange i 5 minutter hver og tørres med en kontinuerlig strøm afN2. Behandl harpiksen med en effektiv spaltningscocktail TFA/TIS/H 2 O (95/2,5/2,5, v/v/v) eller TFA/TIS/EDT/H 2 O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) for peptider indeholdende cysteiner, idet der anvendes ca. 1 ml spaltningscocktail pr. 100 mg harpiks. Behandl den peptidbundne harpiks i 2-3 timer for at spalte peptidet, og fjern derefter TFA'en forsigtigt med en strøm afN2.
- For at opnå de rå peptider tilsættes 4-5 ml diethylether til det spaltede peptidpræparat for at udfælde de rå peptider og centrifugere ved 10.000 × g i 4 minutter. Supernatanten kasseres forsigtigt, og peptidet lufttørres i 3 minutter i en effektiv stinkhætte.
- Analyse af peptiderne: Opløs et råt peptid i lille skala (spaltet fra ca. 10 mg peptidbundet harpiks) i 800 μL acetonitril (ACN)/H2O(1/1, v/v), og analyser derefter ved hjælp af omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) (se materialetabel).
- Oprens peptiderne ved hjælp af RP-HPLC og LC-MS.
- 50 mg råpeptidprodukt opløses i 4 ml ACN/H2O(1/1, v/v), og opløsningen injiceres i et RP-HPLC-system udstyret med en C18-søjle (4,6 mm x 150 mm, porestørrelse: 120 Å, partikelstørrelse: 4 μm; se materialetabel). Eluer peptidet ved hjælp af en mobil fase indeholdende 0,1% TFA/H2O(v/v) og ACN, med en gradient på 10% til 90% ACN over 30 min. Konventionelle peptider blev påvist ved 220 nm og FITC-mærkede peptider ved 494 nm.
- Saml fraktionerne svarende til den vigtigste peptidtop som identificeret af MS, og lyofiliser derefter de ønskede peptidfraktioner. Det oprensede peptid opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Den fundne m/z for den rensede FITC-R8 er som følger: [M + 3 H]3+: 576,63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. De fundne m/z af den rensede FITC-sR8-4 er som følger: [M + 3 H]3+: 704,74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. MS analytiske betingelser: instrument: ESI (sondebias: +4,5 kV; detektor: 1,2 kV); forstøvergasstrøm: 1,5 l / min; buet opløsningslinje (CDL): -20 V; CDL-temperatur: 250 °C; bloktemperatur: 400 °C; strømningshastighed: 0,2 ml / min; mobil fase: 50% H2O/50% ACN.
3. Kvantificering af de FITC-mærkede peptider
- Opløs en lille mængde renset peptid i DMSO som stamopløsning (f.eks. 40 μmol/ml).
- Absorbansen ved 494 nm (A 494) af 2 μL stamopløsning måles i498 μL 10 mM fosfatbufret saltvand (1x PBS, pH 7,4) med en mikrotiterplade (se materialetabellen) ved hjælp af en multiteknologisk mikropladelæser (se materialetabel). Fortyndingsfaktoren er 500 μL / 2 μL = 250, og mikrotiterpladens banelængde er 0,5 mm.
- Stamopløsningens koncentration beregnes ved hjælp af følgende formel:
Koncentration (mM) = A494 × fortyndingsfaktor / 0,05 (cm) / 77.000 (cm-1· M−1) × 1.000 (mM·M−1) - Juster til en korrekt fortynding, så den målte A494-værdi er mellem 0,1 og 1,0.
BEMÆRK: Målingerne skal gentages flere gange for at sikre, at den målte koncentration er nøjagtig. Udryddelseskoefficienten på 77.000 cm-1· M−1 stammer fra FITC-gruppen .
4. Stabilitet af peptider i føtalt bovint serum (FBS)
- Peptidet inkuberes i en koncentration på 100 μM med 250 μL 25% FBS/H2O(v/v) ved 37 °C. Efter inkubation i 0 timer, 1 time, 2 timer og 4 timer udtages 10 μL alikvoter, og derefter tilsættes 150 μl 12% trichloreddikesyre opløst iH2O/ACN (1/3, v/v) for at udfælde serumproteinerne.
- Prøverne centrifugeres ved 10.000 × g i 5 minutter, og supernatanten analyseres med HPLC (som beskrevet i trin 2.8) for at bestemme omfanget af peptidnedbrydningen.
- Forholdet mellem toparealet ved 1 time, 2 timer og 4 timer beregnes og forholdet mellem 0 h for at opnå fraktionen af unedbrudt peptid på det tilsvarende tidspunkt. Resultatet er gennemsnittet af tre parallelle prøver.
5. Cellulær optagelse af peptiderne
- Fluorescens mikroskopisk billeddannelse
- Anbring et rundt dæksel i en plade med 12 brønde. Derefter podes 1 x 105 celler ensartet på dæksedler og dyrkes natten over med 2 ml medium. Fjern mediet og vask cellerne 3x med 1 ml PBS.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev HeLa-celler og 4T1-celler dyrket i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, se materialetabel) suppleret med 10% FBS i en 37 ° C befugtet inkubator indeholdende 5% CO2. - Inkuber cellerne med 1 ml 3 μM FITC-mærkede peptider i FBS-fri DMEM i 1 time ved 37 °C. Fjern derefter det peptidholdige medium og vask cellerne 3x med 1 ml PBS.
- Plet cellerne med 1 ml Hoechst 33258 i 15 min. Overhold internaliseringen af hvert peptid ved hjælp af et fluorescensmikroskop (se materialetabel) med samme fluorescensintensitet og eksponeringstid.
BEMÆRK: Følgende indstillinger blev brugt til fluorescensmikroskopi. Formål: Plan-Apochromat: 63 x/1,40 Olie DIC M27; Kanal 1 for FITC: excitationsfilter: 450-490 nm, emissionsfilter: 500-550 nm, eksponeringstid: 230 ms; Kanal 2 for Hoechst 33258: excitationsfilter: 335-383 nm, emissionsfilter: 420-470 nm, eksponeringstid: 27 ms.
- Anbring et rundt dæksel i en plade med 12 brønde. Derefter podes 1 x 105 celler ensartet på dæksedler og dyrkes natten over med 2 ml medium. Fjern mediet og vask cellerne 3x med 1 ml PBS.
- Flow cytometri analyse
- Der podes 5 x 105 HeLa-celler ensartet i plader med 12 huller og dyrkes i DMEM i 24 timer ved 37 °C. Fjern derefter mediet og vask cellerne 3x med 1 ml PBS.
- Inkuber cellerne med 1 ml 3 μM FITC-mærkede peptider i FBS-fri DMEM i 1 time ved 37 °C. Fjern det peptidholdige medium, dissocier cellerne med 0,25% (w / v) trypsin og 0,53 mM EDTA i PBS i 5 minutter, og opsaml derefter cellerne ved centrifugering ved 306 × g i 4 minutter. Cellepillen vaskes med PBS.
- Inkuber cellerne med 1 ml 0,05% (w / v) trypanblåt i PBS i 3 minutter for at slukke den overfladebundne fluorescens, og udfør kvantitativ analyse af intracellulær fluorescens ved hjælp af et flowcytometer (se materialetabel).
BEMÆRK: Indstillinger for flowcytometri: excitation: 488 nm, emission: 530 nm. Trypanblå kan også slukke fluorescensen af døde celler og hjælpe med at skelne levende / døde celler under analyse af peptidoptagelse. - Behandl og assay 4T1-celler ved hjælp af flowcytometri efter samme protokol som beskrevet for HeLa-celler. Saml 5 x 105 celler pr. prøve og opsæt tre parallelle prøver pr. gruppe.
6. Udforskning af peptidernes celle-til-celle-penetration ved hjælp af transwellmodeller
- 1 x 105 HeLa-celler podes i 2 ml DMEM i et 12-brønds kammer med en vævskulturpladeindsats (se materialetabel) og inkuberes i 24 timer i en 37 °C befugtet inkubator indeholdende 5% CO2. Derefter fjernes mediet og inkuberes cellerne i kamrene med 1 ml 10 μM FITC-R8 eller FITC-sR8-4 (oprenset med HPLC) i FBS-fri DMEM i 1 time.
- Fjern mediet indeholdende peptiderne og vask cellerne 3x med 1 ml PBS. Tilsæt 1 ml frisk FBS-fri DMEM til kamrene, og inkuber derefter HeLa-cellerne i kammeret sammen med vævskulturpladeindsatsen med HeLa-cellerne på de runde dæksedler i bunden i 2 timer.
- Fastgør HeLa-cellerne på de runde dæksler med 2,5% glutaraldehyd i 15 minutter, og pletter derefter cellerne med DAPI i 15 minutter. Derefter observeres HeLa-cellerne på dæksedlerne under et fluorescensmikroskop. Behandl og assay 4T1-celler ved hjælp af den samme protokol som den, der anvendes til HeLa-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev en syntetisk procedure til at begrænse den lineære polyarginin R8 til sin cykliske form præsenteret. SPPS blev udført manuelt ved hjælp af et simpelt apparat (figur 1). Den detaljerede syntetiske proces af SPPS er vist i figur 2. Kort fortalt var harpiksen tilstrækkeligt opsvulmet, efterfulgt af debeskyttelse af N α-Fmoc beskyttelsesgruppen. Derefter blev den N α-Fmoc-beskyttede aminosyre forankret på harpiksen indtil afslutningen af peptidsamlingen (trin 1-4 i figur 2). Derefter blev de rå peptider spaltet fra harpiksen af spaltningscocktailen (trin 5 i figur 2). FITC blev brugt til at mærke peptiderne for at syntetisere fluorescerende mærkede cykliske CPP'er og spore deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer. Derefter blev de tritylbeskyttende grupper af cysteiner selektivt debeskyttet på harpiksen efterfulgt af peptidcyklisering med 4,4'-bis (brommethyl)biphenyl-tværbinding (figur 3A). HPLC- og MS-spektrene for FITC-R8 og FITC-sR8-4 er vist i figur 3B. Retentionstiden for FITC-sR8-4 var væsentligt længere end for den lineære analog, hvilket indikerer forbedret samlet hydrofobicitet af peptidet efter cyklisering med den hydrofobe tværbinding. Som vist i figur 3C forblev den cykliske R8 77,3% intakt efter inkubation med 25% FBS i 4 timer, mens dens lineære modstykke for det meste blev nedbrudt, hvilket tyder på forbedret proteolytisk stabilitet af det cykliske R8-peptid. I de efterfølgende cellebaserede undersøgelser udviste celler behandlet med cyklisk R8 med aromatisk tværbinding højere intracellulær fluorescens end dem, der blev behandlet med dets lineære modstykke, som påvist ved levende cellefluorescensmikroskopibilleddannelse (figur 4A). Lignende resultater blev opnået med flowcytometrianalyse (figur 4B). For yderligere at undersøge, om cyklisk R8 giver forbedret celle-til-celle-penetration, blev transwell-modeller brugt til at simulere peptidernes barrierepermeabilitet fra et cellelag til et andet. Den cykliske R8 udviste klart højere transbarrierepenetration end det lineære R8-peptid, som indikeret ved en signifikant stigning i den intracellulære fluorescens (figur 4C). For at opsummere udviste det cykliske R8-peptid overlegen permeabilitet på tværs af biologiske barrierer over dets lineære modstykke.
Figur 1: Opsætning af udstyr til det manuelle peptidsynteseapparat. En 10 ml polypropylensøjle er opsat på vakuummanifolden ved hjælp af en trevejs stopventil. N2 anvendes til omrøring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Generel procedure for Fmoc fastfasepeptidsyntese (SPPS). En N-α-Fmoc-beskyttet aminosyre er forankret til 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-harpiks (rinkamid MBHA-harpiks) (trin 1) efterfulgt af debeskyttelse af N-α-FMOC-beskyttelsesgrupperne af aminosyrerne (trin 2) og efterfølgende aminosyrekobling (trin 3). Trin 2 og trin 3 gentages flere gange for at syntetisere det ønskede peptid (trin 4). Efter afslutningen af syntesen tilsættes en spaltningscocktail for at fjerne sidekæden, der beskytter grupper, og spalte det ønskede peptid fra harpiksen (trin 5). Forkortelser: DMF = N, N-dimethylformamid; DCM = dichlormethan HATU = 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat; DIPEA = N, N-diisopropylethylamin; TFA = trifluoreddikesyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Syntese af FITC-mærket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-mærket hæftet R8-peptid (FITC-sR8-4) under anvendelse af fastfasepeptidsyntese (SPPS). A) Skematisk diagram over syntesen af FITC-R8 og FITC-sR8-4. B) HPLC- og MS-spektre (indsats) af FITC-R8 og FITC-sR8-4. (C) Stabilitet af FITC-R8 og FITC-sR8-4 ved tilstedeværelse af 25% FBS. Intakt peptid (%) refererer til fraktionen af unedbrudt peptid. Dette tal er blevet ændret fra Shi et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Penetration af FITC-mærket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-mærket hæftet R8-peptid (FITC-sR8-4). (A) Levende cellefluorescensmikroskopibilleder af HeLa-celler og 4T1-celler efter 1 times inkubation med 3 μM FITC-R8 og FITC-sR8-4. FITC (grøn), Hoechst (blå). Skalabjælke = 20 μm. (B) Relativ gennemsnitlig fluorescens (i forhold til det lineære R8-peptid), gennemsnitlig ± s.d. og n = 3; (C) Celle-til-celle penetration af FITC-R8 og FITC-sR8-4 i en transwell-model ved hjælp af HeLa-celler. Levende cellefluorescensmikroskopibilleder (skalabjælke = 20 μm) og relativ gennemsnitlig fluorescens (med hensyn til det lineære R8-peptid), gennemsnit ± s.d. og n = 3. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Shi et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kemiske stabilisering af peptider ved at inkorporere konformationelle begrænsninger har vist sig at være en effektiv strategi til forbedring af peptidets stabilitet og cellepermeabilitet26. I denne protokol beskrives en trinvis procedure for syntese af cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger og evaluering af deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer. Sammenlignet med de hydrofile lactam- eller triazol-tværbindinger22,27 forbedrer inkorporeringen af aromatiske tværbindinger (anvendt i denne undersøgelse) CPP'ernes samlede hydrofobicitet og øger derved deres cellepermeabilitet betydeligt. På den anden side kan peptidcyklisering let opnås gennem substitutionsreaktioner med cysteiner uden at kræve metalkatalysatorer. I denne protokol blev cykliseringen af CPP'erne udført på harpiks; Imidlertid afhænger cykliseringseffektiviteten også af peptidernes specifikke sekvenser og længder på grund af steriske virkninger, hvilket kan resultere i dannelsen af et dimerisk biprodukt28. I et sådant tilfælde ville det være nyttigt at bruge en harpiks med en lavere belastningskapacitet. Derudover anbefales det også at cyklisere disse specifikke peptider under fortyndede koncentrationer i opløsningsfase29.
Der er et par kritiske punkter i denne protokol. For det første anvendes spaltningscocktailen TFA/TIS/EDT/H 2O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) til spaltning af cysteinholdige peptider for at forhindre oxidation af sulfhydrylgruppen. For det andet foreslås det at udføre en mindre indledende undersøgelse for at opnå den passende spaltningstilstand. Den optimale tid, der kræves for at spalte peptiderne fra harpiksen, er 2-3 timer, med en længere spaltningstid (mere end 5 timer), der har tendens til at producere flere uidentificerede biprodukter. Peptidsyntesen kunne overvåges af LC-MS for at optimere spaltningstiden. For det tredje skal FITC-mærkning udføres i mørke for at undgå fluorescensdæmpning.
Desuden bør trypanblåt bruges til at slukke den overfladebundne fluorescens, da flowcytometrianalyse ikke kan skelne mellem intracellulær eller overfladebundet fluorescens. Dette vil bidrage til specifikt at kvantificere peptidet internaliseret af kræftcellerne27. Da kationiske peptider også kan forårsage ikke-specifik membranlysis30, kan hæmolytisk aktivitet og cellelevedygtighed også udføres for at evaluere toksiciteten af de cykliske CPP'er.
Cykliske CPP'er udgør et af de effektive lægemiddelleveringsmidler til at overvinde biologiske barrierer. Imidlertid fører membraninteraktion og forstyrrelse af kationiske CPP'er generelt til potentiel ikke-specifik cytotoksicitet31. Der vil blive gjort en yderligere indsats for at forstå den detaljerede penetrationsmekanisme, som bør bidrage til opdagelsen af den næste generation af cykliske CPP'er, der kan trænge igennem biologiske barrierer med minimal cytotoksicitet. Disse meget aktive og stabile HLP'er rummer store løfter om at forbedre behandlingen af vigtige livstruende sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
