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Developmental Biology

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

ここでは、CRISPR RNP接合子のエレクトロポレーション(CRISPR-EZ)と呼ばれる遺伝子改変マウスの効率的な生成を目的とした簡単な手法について説明します。この方法は、編集試薬をエレクトロポレーションにより胚に100%に近い効率で送達する。このプロトコルは、哺乳類胚における点突然変異、小さなゲノム挿入、および欠失に効果的です。

Abstract

卓越した効率、精度、および容易さを備えたCRISPR/Cas9システムは、細胞培養および実験動物実験におけるゲノム編集を大幅に改善しました。動物モデルを生成する場合、接合子のエレクトロポレーションは、マイクロインジェクションのゴールドスタンダード法の代替として、より高い効率、シンプルさ、コスト、およびスループットを提供します。エレクトロポレーションはまた、より穏やかで生存率が高く、Cas9 /シングルガイドRNA(sgRNA)リボ核タンパク質(RNP)を一般的な実験用マウス系統(C57BL / 6JおよびC57BL / 6Nなど)の接合子に確実に送達し、100%の送達効率に近づきます。この手法により、挿入/欠失(インデル)変異、点突然変異、遺伝子またはエクソン全体の欠失、およびLoxPまたはFLAG、HA、V5などの短いタグを挿入するための100〜200 bpの範囲の小さな挿入が可能になります。ここでは、絶えず改善されていますが、in vitro 転写、胚処理、RNPアセンブリ、エレクトロポレーション、着床前胚のジェノタイピングによるsgRNA産生を含むプロトコルでCRISPR-EZの現状を示します。胚の操作経験が最小限の大学院レベルの研究者は、このプロトコルを使用して1週間未満で遺伝子編集された胚を取得できます。ここでは、マウス胚に使用できる、簡単で低コスト、効率的、大容量の方法を提供します。

Introduction

生きたマウスでのゲノム編集は、CRISPR編集の出現以来、かなり簡素化され、アクセスしやすく、より手頃な価格になりました1,2,3。最初の動物編集の試みでは、マイクロインジェクションを使用してCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAを核期胚に送達しました4,5,6。マイクロインジェクションは非常に効果的ですが、それを完全に習得するために必要な練習の量は、研修生や学生には適切ではない可能性があり、適度な資金のあるラボでは購入できない高価な機器も必要です。マイクロインジェクションは通常、トランスジェニック施設の専門技術者によって行われ、多くの研究者にとってレート制限のあるスケジュールとサービス価格があります。よりアクセスしやすいアプローチはエレクトロポレーションのアプローチであり、これはCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAの前核段階の胚への送達に非常に効果的であることが実証されています7。CRISPRゲノム編集および送達戦略のさらなる改善は、すでにsgRNAと結合している事前に組み立てられたRNPがモザイク現象を低減する効果的な手段である可能性があることを示唆しました8。

このプロトコルの開発と使用の背後にある理論的根拠は、マイクロインジェクションに関連する制限と障害の多くを回避することでした。名前が示すように、マイクロインジェクション実験中にテストされていないsgRNAデザインを使用する価値があるかどうかを迅速に判断できる、簡単で社内の費用対効果の高い方法は、非常に便利なファーストパス品質管理ステップです(図1)。この方法は、組換えベースの結果のために長いドナーDNA配列を導入するなど、より複雑な戦略ではマイクロインジェクションに取って代わることはできませんが、小さな欠失や挿入、遺伝子のタグ付けなどのそれほど複雑でない戦略には理想的です。この方法は、基本的な胚操作スキルを持つ研究者で、単純な編集ニーズを持っている、着床前の開発の時間枠内で仮説をテストしたい、またはマイクロインジェクションの専門家との予約をスケジュールする前に胚でsgRNAをテストしたい研究者に適しています。ここでは、編集試薬は、エレクトロポレーション(一連の電気パルス )を介して Cas9 / sgRNPとして核段階の胚に一過性に送達され、モザイク現象を減らしながら効率を最大化します8。胚ジェノタイピング法を使用すると、編集結果は約1週間9で利用可能になるため、大幅に削減されたコストでさまざまなマイクロインジェクションアプリケーションの必要性が減少します。

この方法の有効性は、胚がまだ母方と父方の前核を融合していない、またはS期に入っていない前核胚段階でピークに達します(図2)。過排卵は接合子の数を最大化するために使用されますが、前核接合子と未受精卵の両方を生成します。健康な接合子は、エレクトロポレーションの前に事前に選択して、全体的な効率を高めることもできます。他のエレクトロポレーションプロトコルは、同様のステップ7、10、11、12、13、14、15を含む必要なしに接合子を効率的に編集しているので、このプロトコルのオプションのステップは、透明帯(ZP)のわずかな侵食である。ZPは、精子の結合、先体反応、および前核段階の胚を取り巻く受精を助ける糖タンパク質層です。私たちの経験では、ZPの穏やかな酸ベースの侵食は、生存率にわずかな影響しか及ぼさずに、信頼性の高いCas9 RNPエレクトロポレーション送達を提供することがわかりました。

C57BL/6JやC57BL/6N 9,16などの研究で一般的に使用されているマウス系統において、エレクトロポレーションによる最大100%の効率のRNP送達率が観察されています。独立したグループはまた、マイクロインジェクション11、12、13、14、15、17よりも高い、またはそれと一致する効率のエレクトロポレーションベースの手順を開発し、エレクトロポレーションプロトコルはラット18、19、ブタ20、21、22、およびウシ23で良好に機能しています。したがって、読者はプロトコルを比較して、実験および機器のニーズに最適な条件を見つけることをお勧めします。ここで説明するシステムは、一般的な材料と機器を使用しており、基本的な胚操作スキルのみを必要とします。この手法は、さまざまな編集戦略に効果的であり、研究コミュニティがこの方法を広く利用できるようにします。

理想的な低分子ガイドRNA(sgRNA)を設計することは、効率的な編集に不可欠です。特にマウス系統の作製が必要な場合は、マウス胚の標的部位ごとに2〜3個のsgRNA戦略を直接スクリーニングすることをお勧めします。設計後は、高品質のsgRNAを作製するためのin vitro転写(IVT)などのクローニングフリーの方法が推奨されます3。RNPおよびsgRNAは、30〜50個の処理された前核期胚と混合され、一連の電気パルスにさらされて最初にZPおよび細胞膜を一時的に透過し、その後のパルスで孔を開いたままにし、接合子24を通してRNPを電気泳動します。最適化の結果、バルク胚(~50)に対して30 Vで6つの3 msパルスが編集効果と生存率に最適であり、非常に効率的なCas9/sgRNA RNP送達を提供することがわかりました9,16,25。個々のマウス桑実胚における編集イベントは、制限断片長多型(RFLP)、T7エンドヌクレアーゼ消化、および関心領域のサンガーシーケンシングなど、CRISPR編集に一般的なさまざまな検証戦略を使用して確認できます26。

現在の方法は、挿入/欠失(インデル)、500〜2000 bp程度のエクソンサイズの欠失、およびC末端またはN末端タグ(FLAG、HA、V5など)などの点突然変異や小さな挿入の送達などの単純な編集スキーム(図3)に最も適しています9,16,27。蛍光タグや条件付き対立遺伝子の大規模な挿入のような複雑なゲノム編集の可能性は依然として不確実であり、今後の改善の現在の焦点です。

この方法は容易に習得でき、培養マウス胚のsgRNAを1週間で迅速に試験するために使用できます9(図1)。この研究で提示されているのは、1)sgRNAデザインを含む6段階のプロトコルです。2)sgRNA合成;3)過剰排卵および交尾;4)胚の培養、収集、および処理。5)RNPアセンブリとエレクトロポレーション。6)胚培養とジェノタイピング。使用されているすべての材料に関する情報が提供されています(材料表)。陽性対照として、チロシナーゼ(Tyr)遺伝子座9,16を編集する試薬が付表1に含まれている。

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Protocol

このプロトコル全体のすべての動物の世話と使用は、動物福祉法の方針である実験動物の世話と使用のためのILARガイドに準拠し、安楽死のためのAVMAとペンシルベニア大学施設動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインと方針に従いました。動物の世話と使用のプロトコルは、このプロジェクトのためにペンシルベニア大学IACUCによってレビューされ、承認されました。コンプライアンスと注意の問題として、このプロトコルを試す前に、必要なすべての承認を求めてください。

1. sgRNAおよびオプションのドナーオリゴ設計

  1. sgRNAデザイン
    1. CRISPR のシーケンススキャン (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 や CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29 など、広く使用されているオンラインアルゴリズムから候補 sgRNA を選択します。各プラットフォームは独自のものであるため、理想的なsgRNAを設計するために、ユーザーインストラクションを注意深くお読みください。イン/デル実験の場合は、テストする2〜3個のsgRNAを選択します。欠失については、標的領域に隣接するsgRNA、例えば、標的の上流に2つのsgRNAおよび標的の下流に2つのsgRNAが示唆される。
      注:さまざまなオンラインsgRNAアルゴリズムは、欠陥のあるsgRNAデザインを回避するためにオフターゲットを考慮に入れていますが、NCBIのBLASTツールは、選択したsgRNA配列の品質を確認するのに役立ちます。
    2. 前のステップ(1.1.1)で決定した19〜20ヌクレオチド(nt)をsgRNAオリゴの可変領域に挿入し(補足表1)、合成したsgRNAをカスタムDNAオリゴとして購入します。
      注: ページのピュアリングは必要ありません。
  2. (オプション)相同性指向修復(HDR)を介したノックインのためのドナーオリゴデザイン。
    1. 所望の実験結果(正確な点突然変異、loxP挿入、小タグ挿入など)に基づいて適切な一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)を設計し、全長を100〜200 ntに保ち、中央領域に50 nt以上の相同性アームを隣接させます。
    2. より高いノックイン効率を確保するには、ssODN30に相補的になるようにsgRNAを設計し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列をサイレント変異に置き換えて、Cas9酵素による繰り返し切断を防ぎます。
    3. カスタムオリゴオプションを使用してssODNを注文します。

2. sgRNA合成

  1. インビトロ転写(IVT)のためのテンプレート生成
    1. PCRを介してsgRNA IVTのDNAテンプレートを生成するには、RNAseを含まないPCRストリップチューブでIVT反応を準備します。( 補足表2を参照)。
    2. 次のサーマルサイクラー条件を使用します。
      95°Cで2分間;95°Cで2分間、57°Cで10秒間、72°Cで10秒間の30サイクル。その後、72°Cで2分間
    3. sgRNA DNAテンプレートPCR反応の成功を検証するために、2%(wt/vol)アガロースゲル上で、5 μLの生成物と1 μLの6xローディング色素を組み合わせて電気泳動しました。
      注:予想される製品サイズは127bpです。残りのPCR反応は、-20°Cで最大5ヶ月間保存できます。
  2. sgRNAのインビトロ転写(IVT)
    1. sgRNAを生成するには、PCRチューブで反応混合物(製造元の指示に従ってT7 IVT)を調製し、フリックして試薬を混合します。
      注:反応のセットアップ例については、 補足表3 を参照してください。IVT反応はRNase汚染に敏感です。したがって、RNaseフリーの環境を提供するためにあらゆる努力を払ってください。
    2. 反応を開始して進行させるには、IVT反応混合物をサーマルサイクラーまたはヒートブロックで37°Cで>18時間インキュベートします。
    3. 元のDNAテンプレートを分解するには(ステップ2.1.3)、1 μLのDNase I(反応あたり2ユニット)を導入し、室温(RT)で20分間インキュベートします。
    4. 磁気精製ビーズへのRNA結合を促進するには、反応に129 μLの100%エタノールを結合し、150 μLになります。
    5. 保存中に沈降する傾向がある精製ビーズを再懸濁するには、アリコートを少なくとも10秒間ボルテックスします。
    6. sgRNAを精製するには、再懸濁したビーズ100 μLをIVT反応(ステップ2.2.4)に加え(ステップ2.2.4)、10倍上下にピペッティングして穏やかに混合します。
    7. 結合を可能にするために、混合物をRTで5分間休ませます。
    8. 取り込まれていない反応生成物からsgRNAを単離するには、反応物を磁気スタンドにRTで5分間置き、小さなペレットが形成されるまで待ちます。
    9. sgRNAを洗浄するには、まず上清を注意深く廃棄し、次にペレットから離して200 μLの80%エタノールを加えます。
      注:80%(vol/vol)エタノール洗浄ステップでは、sgRNA濃度が大幅に低下するため、ピペッティングによるペレットの乱れを避けることが重要です。代わりに、ペレットが水没するように80%エタノールを静かにピペットで固定し、ピペットでボリュームをそっと取り除きます。
    10. 前のステップ(ステップ2.2.9)を繰り返し、ペレットを5〜6分以内で風乾させるか、sgRNAがビーズに永久に結合します。
    11. ペレットを10回ピペッティングし、RT(RT)で2分間インキュベートした後、磁気スタンドに戻し、精製されたsgRNAからビーズを分離することにより、20μLのヌクレアーゼフリー水でsgRNAを溶出します。
    12. sgRNAの質と量を評価するには、分光光度計やバイオアナライザーなどの機器を使用します。あるいは、2%アガロースゲル上で、ステップ2.1.3と同様に2 μLのsgRNAを実行します。
      注意: 品質は単一のクリアバンドによって確認されます。残りのsgRNAは、すぐに使用することも、-80°Cの条件で保存することもできます。

3.過排卵

  1. 各sgRNAデザインをテストするのに十分な胚を提供するには、前述のように、3〜5週齢のC57BL / 6J雌を2〜3匹過剰排卵します9。有効性を確認するのに十分な結果を生成するには、sgRNAあたり20〜30個の胚をエレクトロポレーションすることをお勧めします。
    注:受精が成功した場合は、交配ごとに10〜20個の胚を期待してください。
  2. 排卵を誘発するには、次のホルモン注射スケジュールに従ってください。
    1. 1日目:5 IUの妊娠牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)(100 μL)を、26 Gシリンジを使用した腹腔内(IP)注射で3〜5週齢の雌マウスに投与します。
    2. 3日目:PMSG注射の46〜48時間後、排卵を誘発するためにIP注射を介して5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)(100μL)を注射します。
    3. 繁殖を設定するには、hCG注射直後に、雌と信頼できる繁殖の雄を1:1でペアにします。
      注意: ホルモンが分解して活性を失うのを防ぐために、解凍の30分以内に注射を行ってください。

4.胚の収集と処理

  1. 胚の収集
    1. 前述のように、女性を安楽死させ、必要な資料を取り出すには31、まずは制度的方針に従って適切な方法を確認してください。たとえば、CO2 窒息、頸部脱臼、および/またはその他の承認された方法を使用します。
      注:通常、ホルモン刺激を受けた雌の>75%が交尾プラグを示し、交尾が成功したことを示しています。
    2. 毛が組織の収集を困難にするのを防ぐために、安楽死させた女性を背中に置き、外科的に開く腹部に70%(vol / vol)エタノールをスプレーします。
      注:この時点から、無菌環境を維持し、汚染の可能性を減らすために、換気されたフードで外科的手順を実行することをお勧めします。
    3. 腹腔を開いて卵管を取り除くには、外科用ハサミで皮膚/髪(皮下)層を切り、腎臓の近くにあり、脂肪パッドの一部を共有する卵巣を見つけます(図4)。卵管は卵巣の近位に位置しています(図4)。雌から両方の卵管を外科的に除去し、M2+BSA(4 mg/mL BSA)培地の個々の50 μL液滴に入れます(図5A)。
      注:手順のこのセクションの詳細な手順は、視覚的に表示することができます 31 または、以前に公開されたプロトコルを使用してステップワイズ9 に従うことができます.
    4. 卵母細胞を含む卵母細胞複合体(CoC)を放出するには(図4)、解剖鉗子を使用して、実体顕微鏡で観察しながら卵管の膨大部に傷を付けます。
    5. デブリ(血液、脂肪、組織)の量を減らすには、デブリのキャリーオーバーを避けるために、20〜30 μLに設定されたハンドヘルドピペットを使用して、各CoCをM2+BSA培地の単一の50 μL液滴に移して組み合わせます。
  2. 積雲細胞の除去
    1. 接合子からの卵丘細胞の除去を開始するには(図4)、できるだけ少ない余分な培地を含むCoCを100 μL M2+ヒアルロニダーゼの液滴に移し(図5B)、胚がはるかに小さな積雲細胞から目に見えて分離されるまでCoCをピペッティングして穏やかに混合します。M2 +ヒアルロニダーゼの胚への曝露は、生存率に影響を与える可能性があるため、最小限に抑えるようにしてください。
      注:胚が2分以内に卵丘細胞から分離しない場合は、予熱(37°C)するか、50μLのM2+ヒアルロニダーゼを追加することができます。
    2. ヒアルロニダーゼを希釈し、接合子から緩い積雲細胞を取り除くには、口内ピペットを使用して接合子を新しい50 μL M2+BSA液滴に移します。
      注意: このポイントを超えるほとんどの手順では、特に明記されていない限り、口内操作ピペットを使用する必要があります。ユーザーからの汚染のリスクは低いですが、無菌環境を維持するためにインラインエアフィルターの使用をお勧めします。この機器を調製して使用するには、前述の方法を参照してください9,31。
    3. マウスピペットを使用して、少なくとも4〜5個の50 μL M2 + BSA液滴を胚に通し、卵雲細胞の数を減らします。
  3. (オプション)酸性チロード(AT)溶液による透明帯の菲薄化。
    1. 胚の透明帯を侵食し、試薬送達のための追加の物理的障害を減らすために、胚を60 mmプレート上のAT溶液の予熱(37°C)100 μL液滴に移します(図5C)。透明帯の約30%が侵食されるまで実体顕微鏡を用いて接合子を連続的に観察する9。ATの総被曝は60〜90秒でなければなりません。ATへの長期暴露は、透明帯を完全に溶解し、胚の生存能力を危険にさらす可能性があります。
      注意: 手順のこのセクションの詳細な手順と画像については、以前に公開された方法9,16を参照してください。
    2. ATを希釈するには、マウスピペットを使用して、少なくとも4つの50 μLのM2 + BSA液滴に胚を通過させます。
    3. 適切な数の胚が処理されたかどうかを判断するには、実体顕微鏡を使用して胚を数えます。使用する雌マウスの数にもよりますが、雌あたり約10〜20個の生存可能な接合子が期待できます。
      注:この段階では、胚には量と質の評価を妨げる破片が比較的ないはずです。たとえば、5人の雌を使用する場合、予想される接合子の数は50〜100である可能性が高く、胚を追跡するには機械的なセルカウンターが適切です。受精の失敗や低品質の卵母細胞が排卵するために、胚の約10%〜20%を失うのが一般的です。次のステップでは、胚を50 μLのM2 + BSAにインキュベーター内で30分以内短時間保管します。

5. RNPアセンブリとエレクトロポレーション

  1. RNPアセンブリ
    1. RNP複合体を組み立てるには、添付のサンプル表を使用して、RNPバッファー(ヌクレアーゼフリー水中の100 mM HEPES pH 7.5、750 mM KCl、5 mM MgCl 2、50%グリセロール、および100 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩[TCEP])で目的の編集戦略に基づいて適切な反応混合物を組み合わせます。
      注:TCEPは便利な還元剤ですが、水溶液中での半減期は短いです。したがって、RNPコンプレックスアセンブリの直前にTCEPを追加します。
      1. 非相同末端結合(NHEJ)を介したインデルについては、 補足表4を参照してください。
      2. 相同性指向性修復(HDR)を介した編集については、 補足表5を参照してください。
      3. ペアのsgRNAを使用した工学的欠失については、 補足表6を参照してください。
        1. 戦略に関係なく、PCRチューブ内のRTで目的の試薬を組み合わせます。
        2. RNP複合体形成を可能にするには、混合物を37°Cで10分間インキュベートします。
          注:RNP複合体はRTで最大1時間保存できます。
  2. エレクトロポレーション
    1. エレクトロポレーションの前にBSAを希釈するには、50 μLの還元血清培地の少なくとも2滴に胚を通過させます。
      注:BSAはエレクトロポレーション中の抵抗を増加させ、接合子を損傷する可能性があります。
    2. 接合子(ステップ4.3.2)をエレクトロポレーション用のRNP複合体(ステップ5.1.1.2)と調製して混合するには、マウスピペット25〜30個の胚を10 μLの還元血清培地の液滴に入れ、次にハンドヘルドピペットを使用して10 μLのRNP複合体を追加します(ステップ5.1.1.2)。
    3. RNP複合体から粘性グリセロールを希釈し、サンプルを均質化するには、実体顕微鏡を使用して、10倍または混合物が粘度の兆候(渦巻きパターン)を示さなくなるまでピペッティングして混合します。
    4. エレクトロポレーターに挿入するサンプルを調製するには、この20 μLの胚+ RNP混合物を、気泡を避けながら0.1 cmのエレクトロポレーションキュベットにピペットで入れます。
    5. 編集試薬を接合子に送達するには、30 V、4〜6パルス、3 msパルス長、および100パルス間隔の矩形波プロトコルを使用して胚をエレクトロポレーションします。
    6. キュベットから接合子を回収するには、ハンドピペットを使用して50 μLのKSOM+BSA(1mg/mL BSA)をキュベットの上部に送り、底に沈降した可能性のある胚を洗い流します。この混合物を60 mmプレートに静かにピペットで入れます。
    7. 手順5.2.6を少なくとも2x〜3x繰り返し、ほとんどの胚が回収されるまで、60 mmプレート上で各フラッシュを組み合わせます。
      注:典型的な回復は、最初にロードされた胚の>90%です。胚の生存を確実にするために、インキュベーターをテストし、すべての試薬の有効期限を確認してください。胚は、温度、CO2 レベル、湿度、pHなどの理想的ではない培養条件の影響を受けやすい。

6.胚培養とジェノタイピング

  1. 胚培養
    1. 接合子を目的の段階まで培養するには、マウスピペットを使用して、20〜30個の接合子を事前に平衡化した培養プレート内のKSOM+BSAの液滴に移し、胚を液滴に移動します(図5D)。プレートを5%CO2中で、37°C、湿度95%で一晩インキュベートします。
      注:インキュベーションの前日または少なくとも4時間前に、準備した35mm培養プレートをインキュベーターに入れて事前平衡化します(図5D)。
    2. 理想的な成長条件を促進するには、翌日、実体顕微鏡を使用してKSOM+BSA混合物の新鮮な液滴に2細胞胚のみを移し、インキュベーターに戻します。死んだ胚や未受精の胚は必ず残すか捨ててください。
      注:核期の胚は通常、培養72時間後に桑実胚に成長し、84時間後に胚盤胞に成長します。
  2. ジェノタイピング
    1. PCR反応を妨げる可能性のある培地の成分を希釈するには、マウスピペットを使用して2滴のDPBSを通過させて、桑実胚/胚盤胞胚を洗浄します。
    2. 溶解のために単一胚をロードするには、ピペットを1 μLに設定して個々の胚を8ウェルPCRストリップの1ウェルに移し、次に10 μLの溶解バッファー(50 mM KCl、10 mM Tris-HCl ph 8.5、2.5 mM MgCl 2、0.1 mg/mLゼラチン、0.45%ノニデットP-40、0.45%トゥイーン20、ヌクレアーゼフリーH 2 O中の0.2mg/mLプロテイナーゼK)を加えます。
      注:溶解バッファーを調製する直前にプロテイナーゼKを追加します。
    3. 胚を溶解するには、サーマルサイクラーを55°Cで4時間プログラムし、95°Cで10分間インキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化します。
      注:特に初めてのユーザーの場合は、 Tyr 遺伝子座で編集実験を試してください。このワークフローは最適化されており、ポジティブコントロールとして機能します。必要に応じて、PCR分析の前に、胚溶解液を4°Cで2〜3日間、または冷凍庫で最大2週間保存します。凍結融解サイクルの繰り返しを防ぎます。
    4. ジェノタイピング解析が成功する可能性を高めるには、標的部位に隣接するわずかに長いDNA断片と、より正確なDNA断片を増幅するために使用される領域を増幅することにより、ネストされたPCR戦略を実行します。 別表7の条件に従ってください。
    5. 以下のサーマルサイクラーの条件に従ってください。
      95°Cで2分間
      30+サイクル:95°Cで2分間、60°Cで10秒間、72°Cで10秒間
      72°Cで2分間
    6. ネストされたPCR戦略の第2段階を準備するには、最初のPCR産物を1:10に希釈し(ステップ6.2.5)、これを次のPCR反応に2 μLロードします(前のアンプリコン内にあるように設計されたプライマーを使用)。
      注:最初のPCR反応は、2番目のPCR反応における隣接プライマーのキャリーオーバーを減らすために希釈する必要があります。 別表 8 の手順に従って、ネストされた PCR を準備します。
    7. PCR反応を次のサイクリング条件を使用してサーマルサイクラーに配置します。
      95°Cで2分間
      30サイクル:95°Cで2分間、60°Cで10秒間、72°Cで10秒間
      72°Cで2分間
      注:通常、PCR反応の>90%は、アンプリコンサイズが500bp以下の場合に成功します。
    8. (オプション制御) Tyr をポジティブコントロールとして使用するNHEJ媒介in/del変異の場合、20 μLの反応で10 UのHinfIを使用して37°Cで4時間インキュベートすることにより、ステップ6.2.7のネストされたPCR産物の10 μLを消化します( 補足表9を参照)。2%アガロースゲルで、消化産物を実行して編集を評価し、非消化PCR産物をローディングコントロールとして使用します。ゲルを135 Vで30分間実行します。
      注:適切な制限酵素としてのHinfIの使用は、NHEJ編集が成功するとアブレーションされると予測されるsgRNA標的領域内に存在する便利な場所にあるHinfIサイトのために選択されました。詳細な方法および結果は、以前に記載されている9、16。
    9. (オプション制御) Tyr をポジティブコントロールとして使用するHDR媒介変異の場合、20 μLの反応で10 UのEcoRIを使用して37°Cで4時間インキュベートすることにより、ステップ6.2.7のネストされたPCR産物の10 μLを消化します( 補足表10を参照)。2%アガロースゲルで、消化産物を実行して編集を評価し、非消化PCR産物をローディングコントロールとして使用します。ゲルを135 Vで30分間実行します。
      注:診断制限酵素としてのEcoRIの選択は、sgRNA標的領域に見られる元の配列を利用しており、HDRが成功すると、天然に存在するHinfIサイトがEcoRIサイトに置き換えられ、 Tyr 遺伝子を妨害するフレームシフト変異が強制されます。HDR分析では、両方の結果が発生する可能性があり、モザイクの決定に役立つ可能性があるため、各サンプルに対してNHEJ(ステップ6.2.8)とHDR(ステップ6.2.9)の両方の分析を実行します。詳細な方法および結果は、以前に記載されている9、16。

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Representative Results

この方法では、効率的なCas9/sgRNPアセンブリのために、100 μgを超えるsgRNA(>6,000 ng/L濃度で20 μL)が生成されます。ここで説明するルーチンの過剰排卵法は、通常、プラグされた女性あたり10〜20個の生存可能な胚を生成します。胚操作に関連する取り扱いエラーと典型的な損失により、予想される胚の80%は受精し、生存可能で、エレクトロポレーション後に優れた状態にあります。研究者が実験を成功させるのを支援するために、オリゴデザイン(図6A、補足表1)やNHEJイベントとHDRイベントの両方のジェノタイピング戦略(図6B)(ステップ6.2)を含む、マウスTyr遺伝子座をポジティブコントロールとして標的とする戦略の例を提供しました(図6)。実験の成功と結果の詳細な例が利用可能です9,16。

このプロトコルをマイクロインジェクションと比較するための以前の取り組みでは、マウスモデルを生成するための7つの異なるラボを含む30を超える異なる編集の試みがすべて成功しました9,16。さらに、この方法は、哺乳類の発生における最初の必須レトロトランスポゾンの調査と報告に使用されました27。単一のsgRNAを送達するなどの単純な戦略を使用した場合、RNPの送達は、C57BL/6JおよびC57BL/6Nマウス系統で最大100%を含み、in/del形成は50〜100%で発生し、小さなオリゴベースの置換は14%〜63%の範囲でした9,16(表1)。ゲノム欠失を操作する場合、編集効果は3%から100%まで変化し得、寄与因子にはゲノム位置、sgRNA設計、および欠失のサイズが含まれる(表2)。たとえば、1,000bp未満の削除は、1,000bpを超える削除よりも成功します9,16。

エレクトロポレーションに60個の胚を使用する場合、このプロトコルは編集効果の点でマイクロインジェクションを上回り、マイクロインジェクション9の1つのファウンダーと比較して3〜4匹のファウンダー動物になります。同一のsgRNAを用いたC57BL/6Nマウス系統の遺伝子ノックアウト実験では、この方法はマイクロインジェクションを上回り、平均4匹の創始者動物9が得られました(表2)。V5 や HA タグ付けなどの小さな挿入では、最大 162 nt の ssODN のテストに成功しており、現在、1000 から 2000 nt までのスケールアップを目指しています。これらの実験の成功は、HDRの結果が堅牢であるために使用されるsgRNAの有効性に大きく依存します。ほぼすべてのHDRの結果はモザイクですが、胚の31%〜64%が挿入の証拠を示しています9,16。

Figure 1
図1:CRISPR-EZの概要。 ワークフローのグラフィカルな概要。戦略とデザインが作成されると、編集された胚は約1週間で生成およびテストできます。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。と陳ら16。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:手順を実行する理想的なタイミング。 この図は、受精後の最初の細胞分裂中の関連する特徴と時点を示しています。このアプローチを実行するために、研究者は、形態学的変化、細胞サイクル時間の推定、および最初の切断の前に頻繁に観察される化学マーカーなどのいくつかの目に見える手がかりを提供されます。授精と受精の正確なタイミングは不明であるため、賢明な推奨事項は、0時間を真夜中と見なすことです。接合子がS期に入る前に、NHEJまたはHDRの編集機械を提供する理想的な瞬間であり、これは午前7時から午前11時の間にこのプロトコルを実行することを意味します。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:編集戦略の成功。 単一のsgRNAなどの単純な戦略は、NHEJ修復を介したin/delまたはHDR を介した ssODNテンプレートと組み合わせると精密な突然変異をもたらします。NHEJ修復は、複数のsgRNAを用いた欠失に利用することもできます。一般に、戦略が単純であればあるほど、CRISPR-EZはそれ以上の最適化なしでより効果的になります。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:卵管とアンプラの位置。 生殖組織を外科的に隔離した後、鉗子で脂肪パッドに穏やかな圧力を加えることによって領域を確保する必要があります。脂肪パッドは、卵巣/卵管を傷つけないように操作するのに比較的安全な領域です。破線の正方形の領域を取り除き、さらなる解剖のためにM2の液滴に入れる必要があります。漫画の図は、関連する解剖学的構造がラベル付けされた関心領域を示しています。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:推奨される処理と培養プレートのセットアップ。 研究者が胚の処理と培養の両方を行うのに役立つさまざまなプレートセットアップを示す概略図。(A)典型的なM2 + BSAウォッシュプレート。(B)卵丘細胞除去用のM2+ヒアルロニダーゼプレート。(C)帯間伐用のオプションのAT溶液プレート。(D)胚培養用のKSOM+BSAプレートで、pH、湿度、温度を維持するために必要な鉱物油オーバーレイ。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:NHEJおよびHDRの結果のジェノタイピングの例 。 (A)マウスゲノム中の Tyr 遺伝子周辺領域の漫画図。以下は、sgRNAの標的認識部位内にある天然に存在するHinfI制限部位が見出される未編集(WT)配列の詳細である(赤いテキスト)。この下は、CRISPR/Cas9ターゲティングが成功した後に考えられる多くの結果の1つであり、「in/del」が形成されます。この編集の正確な性質を予測することは困難ですが、ほぼ確実にHinfIサイトを混乱させるでしょう。さらに下には、2つの塩基対を変化させてHinfI部位をEcoRI認識部位に変えるドナーオリゴ配列があります。(B)編集後の代表的な制限断片長多型(RFLP)の結果。NHEJ(上)とHDR(下)の編集例を示します。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。この図は、Modzelewskiらの許可を得て修正されています9。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:Tyr編集接合子およびマウスの表現型および生存率。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て翻案されています9。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:CRISPR-EZおよびマイクロインジェクション欠失実験の結果。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て翻案されています9。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:オリゴとドナーssODNのリスト。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て翻案されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表2:sgRNA反応セットアップ用のDNAテンプレート。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て翻案されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表3: in vitro 転写セットアップ。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て変更されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表4:NHEJ形成のためのRNP複合体のセットアップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表5:HDR形成のためのRNPコンプレックスセットアップ。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て翻案されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表6:削除のためのRNPコンプレックスセットアップ。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て変更されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表7:ジェノタイピングPCRのセットアップ。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て変更されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表8:ネストされたジェノタイピングPCRのセットアップ。 この表は、Modzelewskiらの許可を得て変更されています9。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表9:HinfI制限ダイジェストのセットアップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 10: EcoRi 制限ダイジェストのセットアップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、簡単で高効率なマウスゲノム編集技術を紹介します。エレクトロポレーションは、1〜2週間で改変胚を生成するために使用でき(図1)、6週間以内に編集されたマウスを作製することができる9。RNP 7、10、11、12、13、14、15、17、32を送達する同時期に開発されたエレクトロポレーションベースのプロトコルと比較して、ここで説明する方法は概念的に類似しており、試薬の開発とパラメータにわずかな違いがあるだけで、同じ範囲の効率を提供します。したがって、読者はニーズと機器へのアクセスに基づいて比較対照することをお勧めします。名前が示すように、このプロトコルは「平均的なマウスラボ」を念頭に置いて開発され、一般的な方法(IVT、PCR、ゲル電気泳動)、試薬(標準的な胚および組織培養消耗品)、または機器(細菌トランスフェクションに一般的に使用されるエレクトロポレーターおよびキュベット)のみを使用して開発され、胚を収集できるほとんどのラボがアクセスできる可能性があります(または近隣のラボに親切に尋ねることによって)。基本的な胚処理スキルを持つ大学院生レベルの研究者は、コア施設でスケジュールを立てることなく、着床前開発の時間枠内でsgRNAの効率をテストしたり、データ生成実験を複数回実施したりできます。しかしながら、所望の目標がマイクロインジェクションまたは胚操作のいずれかを必要とせずに動物モデルを生成することであるならば、より侵入的でない方法が利用可能である10、32。

ゲノム標的の特異性、sgRNA配列パラメータ、ゲノムアクセシビリティとトポロジー、特に細胞タイプなど、Cas9の効率に影響を与える多くの要因が活発に研究されています。したがって、sgRNAの設計とテストは成功のために不可欠です。このプロトコルと他の独自に開発されたエレクトロポレーション法は、Cas9タンパク質/ sgRNPを接合子期の胚に迅速かつ一過性に送達するように最適化されており、発生初期の送達とRNPの短い半減期によるモザイクを最小限に抑えながら効率を高めています7,9,10,11,12,13,14,15。16,33,34。

最も一般的なゲノム編集戦略およびマウスのさまざまな系統にとって、この方法は、コスト、効率、小さな挿入、in/del突然変異、エクソン欠失、挿入、および点突然変異の点でマイクロインジェクションよりも優れています9。現在のプロトコルでは、この方法は、タンパク質をコードするエクソンの典型的な長さである170 bp35よりもはるかに長い、最大2.6 kbのin/del変異および欠失の生成に理想的です。長い削除は効率が低くなります。ただし、この制限はこのプロトコルに固有のものではありません。したがって、Cas9を介した編集が改善され、新しいCasタンパク質バリアントが開発されるにつれて、この方法のモジュール性により、これらの改善により、プロトコルの機能を直接強化できます。

この方法はさまざまな簡単な編集を実行できますが、条件付き対立遺伝子や蛍光タグの挿入など、より大きく複雑な戦略の可能性は現在、私たちの研究室でテストされています。より長いssODNは、複雑なゲノム編集のための実行可能なアプローチを提供する可能性があり、マイクロインジェクションベースの胚編集で成功を示しています36。ただし、より長いssODNは合成に費用がかかり、エレクトロポレーション37ではまだ広範囲にテストされていません。アデノ随伴ウイルス(AAV)を使用して最大3.3 kbのドナー配列を導入することも成功していますが、ほとんどのラボではアクセスできない可能性があります25。当面は、複雑なマウスゲノム工学のために、標準的な胚性幹細胞ゲノム編集とマイクロインジェクションをお勧めします。

Cas9のオフターゲット効果に関する懸念は8,38,39のままです。操作されたCas9変異は標的特異性を高める可能性があるが、これはRNP胚エレクトロポレーション研究では十分に調査されていない。CRISPR-EZは、複雑な遺伝学を探索するための化合物突然変異モデルを作成するための有用な方法である可能性があります。マイクロインジェクションにより、複数の遺伝子座を同時に編集することが可能になりましたが40、ここで説明するようなエレクトロポレーション法は、これをより便利で効果的にします。

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Disclosures

著者による関連する財務申告はありません。

Acknowledgments

A.J.M.は、CRISPR-EZの開発につながる独自のコンセプトを作成し、フィギュアを作成しました。C.K.D.は、この現在の原稿のために内部および公開されたプロトコルを編集および適応させました。A.J.M. は NIH (R00HD096108) によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

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発生生物学 第190号
接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集
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