Murine fækal isolering og mikrobiota transplantation
Summary
Målet her er at skitsere en protokol til at undersøge mekanismerne for dysbiose i hjerte-kar-sygdomme. Dette papir diskuterer, hvordan man aseptisk indsamler og transplanterer murine fækale prøver, isolerer tarmene og bruger “Swiss-roll” -metoden efterfulgt af immunfarvningsteknikker til at forhøre ændringer i mave-tarmkanalen.
Abstract
Gut mikrobiota dysbiose spiller en rolle i patofysiologien af kardiovaskulære og metaboliske lidelser, men mekanismerne er ikke godt forstået. Fækal mikrobiotatransplantation (FMT) er en værdifuld tilgang til afgrænsning af en direkte rolle af den samlede mikrobiota eller isolerede arter i sygdomspatofysiologi. Det er en sikker behandlingsmulighed for patienter med tilbagevendende Clostridium difficile-infektion . Prækliniske undersøgelser viser, at manipulation af tarmmikrobiota er et nyttigt værktøj til at studere den mekanistiske forbindelse mellem dysbiose og sygdom. Fækal mikrobiota transplantation kan hjælpe med at belyse nye tarmmikrobiota-målrettede lægemidler til styring og behandling af kardiometabolisk sygdom. På trods af en høj succesrate hos gnavere forbliver der translationelle ændringer forbundet med transplantationen. Målet her er at give vejledning i at studere virkningerne af tarmmikrobiom i eksperimentel hjerte-kar-sygdom. I denne undersøgelse beskrives en detaljeret protokol for indsamling, håndtering, behandling og transplantation af fækal mikrobiota i murine undersøgelser. Indsamlings- og behandlingstrinnene er beskrevet for både humane donorer og gnaverdonorer. Endelig beskriver vi brugen af en kombination af de schweiziske rulle- og immunfarvningsteknikker til at vurdere tarmspecifik morfologi og integritetsændringer i hjerte-kar-sygdomme og relaterede tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometaboliske lidelser, herunder hjertesygdomme og slagtilfælde, er de førende globale dødsårsager1. Fysisk inaktivitet, dårlig ernæring, fremskreden alder og genetik modulerer patofysiologien af disse lidelser. Akkumulerende beviser understøtter konceptet om, at tarmmikrobiota påvirker kardiovaskulære og metaboliske lidelser, herunder type 2-diabetes2, fedme3 og hypertension4, som kan indeholde en nøgle til udviklingen af nye terapeutiske tilgange til disse sygdomme.
De nøjagtige mekanismer, hvormed mikrobiota forårsager sygdomme, er stadig ukendte, og aktuelle undersøgelser er meget variable, delvis på grund af metodologiske forskelle. Fækal mikrobiotatransplantation (FMT) er en værdifuld tilgang til afgrænsning af en direkte rolle af den samlede mikrobiota eller isolerede arter i sygdomspatofysiologi. FMT anvendes i vid udstrækning i dyreforsøg til at inducere eller undertrykke en fænotype. For eksempel kan kalorieindtag og glukosemetabolisme moduleres ved at overføre fækalt stof fra en syg donor til en sund modtager 5,6. Hos mennesker har FMT vist sig at være en sikker behandlingsmulighed for patienter med tilbagevendende Clostridium difficile-infektion 7. Der er ved at dukke beviser op til støtte for dets anvendelse i håndteringen af hjerte-kar-sygdomme; For eksempel forbedrer FMT fra patienter med magert til metabolisk syndrom insulinfølsomheden8. Tarmdysbiose er også forbundet med forhøjet blodtryk i både humane og gnaverundersøgelser 9,10,11. FMT fra mus, der fodres med en kost med højt saltindhold i kimfrie mus, disponerer modtagerne for betændelse og hypertension12.
På trods af den høje FMT-succes hos gnavere er der stadig translationelle udfordringer. Kliniske forsøg med FMT til behandling af fedme og metabolisk syndrom indikerer minimal eller ingen effekt på disse lidelser13,14,15. Således er der behov for flere undersøgelser for at identificere yderligere terapeutiske veje rettet mod tarmmikrobiota til behandling af kardiometaboliske lidelser. De fleste af de tilgængelige beviser på tarmmikrobiota og hjerte-kar-sygdomme er associative. Den beskrevne protokol diskuterer, hvordan man kan udnytte en kombination af FMT og den schweiziske rulleteknik til at vise både en sammenhæng mellem sygdom og tarmmikrobiota og direkte vurdere integriteten af alle dele af tarmtarmen16,17,18.
Det overordnede mål med denne metode er at give vejledning til undersøgelse af virkningerne af tarmmikrobiomet i eksperimentel hjerte-kar-sygdom. Denne protokol giver flere detaljer og nøgleovervejelser i det eksperimentelle design for at fremme fysiologisk oversættelse og øge stringensen og reproducerbarheden af resultaterne.
Protocol
Representative Results
Discussion
En værdifuld tilgang til at studere tarmmikrobiotas kausale rolle i kardiovaskulær og metabolisk sygdom er at overføre den samlede mikrobiota eller vælge arter af interesse til kimfrie mus. Her beskriver vi protokoller til indsamling af fækale prøver fra mennesker og konventionelt husede mus i kimfrie mus for at studere tarmmikrobiotas rolle i hypertensive lidelser.
Hos mus bruger vi aseptisk opsamlet cecalindhold behandlet i et aerobt kammer, og hos mennesker samler afføring. FMT kan u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (til A.K.) fra National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (til J.A.I.); og National Heart, Lung and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (til AK) og NIH-tilskud 1P01HL116263 (til V.K.). Figur 1 blev oprettet ved hjælp af Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
