हम वर्णन करते हैं कि कृन्तकों में आंतों के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सर्जिकल मॉडल कैसे उत्पन्न किया जाए। प्रक्रिया में रक्त प्रवाह की बहाली के बाद बेहतर मेसेंटेरिक धमनी का रोड़ा शामिल है। यह मॉडल पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा दोनों में आंतों के आईआरआई के रोड़ा कारणों की जांच के अध्ययन के लिए उपयोगी है।
आंतों के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा दोनों में स्थितियों के असंख्य के साथ जुड़ा हुआ है। आंतों की आईआरआई स्थितियां, जैसे गैस्ट्रिक फैलाव वॉल्वुलस (जीडीवी), मेसेंटेरिक मरोड़ और शूल, कुत्तों और घोड़ों जैसे जानवरों में देखी जाती हैं। रक्त प्रवाह के प्रारंभिक रुकावट के कारण ऊतक इस्केमिक हो जाते हैं। हालांकि व्यवहार्य ऊतक को उबारने के लिए आवश्यक है, बाद में reperfusion आगे की चोट को प्रेरित कर सकता है। आईआरआई के लिए जिम्मेदार मुख्य तंत्र क्षतिग्रस्त ऊतक में ऑक्सीजन के पुनरुत्पादन और पुनरुत्पादन पर मुक्त कट्टरपंथी गठन है, लेकिन इसमें कई अन्य घटक शामिल हैं। परिणामी स्थानीय और प्रणालीगत प्रभाव अक्सर एक खराब पूर्वानुमान प्रदान करते हैं।
आंतों आईआरआई पिछले 50 वर्षों में व्यापक शोध का विषय रहा है। एक विवो कृंतक मॉडल में जिसमें बेहतर मेसेंटेरिक धमनी (एसएमए) का आधार अस्थायी रूप से लिगेट किया जाता है, वर्तमान में आंतों के आईआरआई का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम विधि है। यहां, हम 21% ओ2 चिकित्सा हवा में आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण का उपयोग करके आंतों के आईआरआई के एक मॉडल का वर्णन करते हैं जो प्रजनन योग्य चोट पैदा करता है, जैसा कि छोटी आंतों के लगातार हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा प्रदर्शित किया गया है। बृहदान्त्र, यकृत और गुर्दे में ऊतक की चोट का भी आकलन किया गया था।
इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) किसी भी अंग में हो सकती है और इसमें दो अनुक्रमिक घटक शामिल होते हैं। रक्त प्रवाह की प्रारंभिक समाप्ति प्रभावित ऊतकों को इस्केमिक बनने का कारण बनती है और फिर बाद में reperfusion आगे सेल की चोट को प्रेरित करता है। reperfusion से नुकसान अक्सर ischemia1 के कारण होता है कि अधिक है. आईआरआई के पैथोफिज़ियोलॉजी में घटनाओं का एक जटिल झरना शामिल है, जिनमें से सबसे उल्लेखनीय ऑक्सीजन के पुनरुत्पादन पर मुक्त कट्टरपंथी गठन है, जो रिपरफ्यूजन2 के दौरान होता है। भड़काऊ कोशिकाओं और साइटोकिन्स की सक्रियता भी एक भूमिका निभातीहै 2. आंतों के आईआरआई के मामलों में, एंडोथेलियल क्षति के बाद रक्तप्रवाह में जीवाणु स्थानांतरण प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया सिंड्रोम2 का कारण बन सकता है। यदि आईआरआई के कारण क्षति काफी गंभीर है, तो परिणामी प्रणालीगत प्रभाव बहु-अंग विफलता का कारण बन सकतेहैं।
आंतों आईआरआई के मामलों उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 4,5,6 के साथ जुड़े रहे हैं. आंतों का आईआरआई पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा दोनों में कई रोग स्थितियों और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ है। पशु चिकित्सा में, जानवरों को विशेष रूप से आंतों आईआरआई स्थितियों, जैसे गैस्ट्रिक फैलाव वॉल्वुलस (जीडीवी), मेसेंटेरिक मरोड़, और शूल 7,8 से ग्रस्त हैं। मनुष्यों में, आईआरआई पेट महाधमनी धमनीविस्फार सर्जरी, गला घोंटने वाले हर्निया, तीव्र मेसेंटेरिक इस्किमिया, वॉल्वुलस, आघात, सदमे, नवजात नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस, और छोटे आंत्र लकीर या प्रत्यारोपण9 में एक प्रमुख और अक्सर होने वाली समस्या है।
आंतों आईआरआई के विवो कृंतक अध्ययन में अधिकांश बेहतर मेसेंटेरिक धमनी (एसएमए) के आधार का रोड़ा शामिल है, उदर महाधमनी की शाखा जो छोटी आंतों के बहुमत और बड़ी आंतों के समीपस्थ भाग 10,11,12को रक्त की आपूर्ति करती है। इस मॉडल के व्यापक उपयोग और सापेक्ष सादगी के बावजूद, 21% ओ2 चिकित्सा हवा में इनहेलेंट संज्ञाहरण का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित नहीं किया गया है। एक मानक प्रोटोकॉल की कमी उन शोधकर्ताओं के लिए कठिनाई पैदा करती है जो प्रक्रिया से अपरिचित हैं और अध्ययनों में स्थिरता को रोकते हैं। हम 8-14 सप्ताह के पुरुष और महिला स्विस वेबस्टर चूहों में आंतों आईआरआई के सर्जिकल मॉडल का संचालन करने के लिए आवश्यक चरणों का प्रदर्शन करते हैं। आंतों के आईआरआई का यह मॉडल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट पैदा करता है, जैसा कि लगातार हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा प्रदर्शित किया गया है।
इस आंतों के आईआरआई मॉडल के व्यापक उपयोग के बावजूद, यह इसकी सीमाओं के बिना नहीं है। उदाहरण के लिए, एसएमए के आधार का एकमात्र रोड़ा आंत में रक्त के प्रवाह को पूरी तरह से बाधित नहीं करता है। यह मेसेंटरी में व्यापक संपार्श्विक परिसंचरण के कारण होने की संभावना है, जो पेट की महाधमनी की पड़ोसी शाखाओं से रक्त खींच सकता है। बिल्लियों में एक अध्ययन में, एसएमए रोड़ा समीपस्थ ग्रहणी में 35%, डिस्टल ग्रहणी में 61%, जेजुनम और इलियम में 71% और समीपस्थ बृहदान्त्र में 63% तक रक्त प्रवाह में कमी आई। रक्त का प्रवाह मध्य और बाहर का बृहदान्त्र में कम नहीं किया गया था, जो अवर mesenteric धमनी23 से उनके परिसंचरण के ज्यादा प्राप्त. कृन्तकों में, जेजुनम और इलियम को अक्सर आंतों के खंडों के रूप में उद्धृत किया जाता है जो एसएमए रोड़ा9 के बाद सबसे महत्वपूर्ण ऊतक की चोट लगाते हैं।
एसएमए रोड़ा के बाद इस्किमिया समय की एक विस्तृत श्रृंखला को साहित्य में 1 से 90 मिनट या उससे अधिक तक उद्धृत किया गया है। अलग-अलग इस्केमिक समय के परिणामस्वरूप रीपरफ्यूजन चोट के विभिन्न स्तर होते हैं; पार्क एट अल मनाया reperfusion चोट जब इस्कीमिक अंतराल 40 और 60 मिनट के बीच था, लेकिन नहीं जब इस्कीमिक अंतराल कम या अब24 था. इस तरह के परिणाम बताते हैं कि कम समय में reperfusion चोट को उकसाने के लिए पर्याप्त ischemia का उत्पादन नहीं करते हैं, जबकि लंबे समय तक ऊतक इतनी गंभीर रूप से नुकसान होता है कि यह reperfusion चोट है कि यह असंभव है कि इस प्रकार reperfusion चोट का प्रदर्शन करने के लिए है. इसके अलावा, लंबे समय तक इस्केमिक समय में मृत्यु दर में वृद्धि का जोखिम होता है। जैसा कि हमारे अध्ययन में देखा गया है, प्रारंभिक चूहों में से 50% (3/6) जो 60 मिनट इस्किमिया से गुजरते थे, केवल 90 मिनट के पुनरावृत्ति के बाद मृत्यु हो गई। 45 मिनट के लिए ischemia समय छोटा ऊतक चोट स्कोर बदलने के बिना मृत्यु दर 20% (1/5) को कम कर दिया. हमारे अध्ययन के आधार पर, ऐसा प्रतीत होता है कि इस्केमिक क्षति की आदर्श खिड़की लगभग 45 मिनट के लिए एसएमए रोड़ा द्वारा प्राप्त की जा सकती है।
एक अन्य चर ऊतक संग्रह से पहले reperfusion समय है. इस्किमिया समय के साथ, reperfusion बार अध्ययन भर में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, 60 मिनट से 24 घंटे से अधिक. कई कागजात ने बताया है कि आंतों के श्लेष्म को 2 से 3 घंटे के रिपरफ्यूजन पर अधिकतम रूपात्मक क्षति होती है, जिसमें 24 घंटे25,26,27 पर पूरी मरम्मत की जाती है। इस 2 से 3 घंटे खिड़की जोखिम से पहले ऊतक इकट्ठा reperfusion चोट की पूरी सीमा पर कब्जा नहीं है, जबकि ऊतकों 24 घंटे के करीब काटा पहले से ही मरम्मत की प्रक्रिया शुरू कर दिया होगा. हमने शुरू में 120 मिनट के reperfusion समय का विकल्प चुना, लेकिन फिर मृत्यु दर को कम करने के प्रयास में 90 मिनट में बदल गया। इस परिवर्तन ऊतक चोट परिणाम नहीं बदला, सुझाव है कि 2 से 3 घंटे खिड़की से एक 30 मिनट विचलन स्वीकार्य है.
आईआरआई के विकास में ऑक्सीजन एकाग्रता भी एक महत्वपूर्ण चर है। वाइल्डिंग एट अल ने पाया कि, 21% ओ2 प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में, आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी उन लोगों को 100% ओ2 अनुभवी वेंटिलेशन-छिड़काव बेमेल के कारण एटेलेक्टैसिस के साथ वितरित किया गया था। एक ही अध्ययन में, 100% हे2 प्राप्त चूहों तीव्र श्वसन एसिडोसिस और ऊंचा मतलब धमनीदबाव 28 विकसित. आईआरआई जैसी चोट को प्रेरित करते समय इस तरह के शारीरिक परिवर्तनों से सबसे अच्छा बचा जाता है, जिसमें कई प्रणालीगत कारक शामिल होते हैं। इस प्रकार, 21% O2 आइसोफ्लुरेन डिलीवरी के लिए वाहक गैस के रूप में 100% O2 से अधिक उपयुक्त लगता है।
इस प्रोटोकॉल में हेपरिन का उपयोग बहस के लिए खुला है। हेपरिन विरोधी जमावट और विरोधी भड़काऊ प्रभाव29 के लिए जाना जाता है. हमने पाया कि 60 मिनट इस्किमिया और 120 मिनट reperfusion से 45 मिनट ischemia और 90 IU / किग्रा हेपरिन के साथ 400 मिनट reperfusion से बदलने सूक्ष्म आंतों की चोट नहीं बदला है, लेकिन कम मृत्यु दर किया. एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि हेपरिन ने फेफड़ों और मस्तिष्क जैसे दूर के अंगों को घातक थ्रोम्बोम्बोलिज़्म को रोका, हालांकि हमें मरने वाले शुरुआती दो चूहों की सकल या सूक्ष्म परीक्षा द्वारा नेक्रोप्सी पर इसका सबूत नहीं मिला। हेपरिन के बिना छोटे इस्किमिया और रीपरफ्यूजन समय का उपयोग करना मृत्यु दर को कम करने में उतना ही प्रभावी हो सकता है। यदि ऐसा होता, तो आईआरआई के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए हेपरिन के उपयोग को त्यागना समझदारी होगी। हालांकि, प्रोटोकॉल में हेपरिन सहित आईआरआई के शल्य चिकित्सा कारणों मॉडल करने के इच्छुक लोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है, क्योंकि शल्य चिकित्सा रोगियों को अक्सर हेपरिन पेरी-ऑपरेटिव प्राप्त होता है।
आइसोफ्लुरेन को आंतों की सूजन और इस्किमिया के मामलों में ऊतक सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया गया है, और इसका उपयोग नैदानिक रूप से प्रासंगिक आईआरआई मॉडल30,31,32के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। हालांकि, ऑर्गोफ्लोरीन इनहेलेंट (यानी, आइसोफ्लुरेन, सेवोफ्लुरेन) आमतौर पर पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा दोनों में एनेस्थेटिक्स का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक संज्ञाहरण की लंबाई 120 मिनट से अधिक है, और इस प्रकार एक इनहेलेंट एक छोटे-अभिनय इंजेक्शन की तुलना में अधिक उपयुक्त है जिसे फिर से खुराक देने की आवश्यकता होगी।
समीपस्थ बृहदान्त्र, यकृत या गुर्दे में कोई सूक्ष्म घाव मौजूद नहीं थे। सूक्ष्म परिवर्तनों की कमी शायद अपेक्षाकृत कम 90 से 120 मिनट reperfusion समय के कारण थी. इसके अलावा, समीपस्थ बृहदान्त्र में अवर मेसेंटेरिक धमनी से रक्त की आपूर्ति होती है। हालांकि, दृश्यमान क्षति की कमी प्रणालीगत चोट से इंकार नहीं करती है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) संभवतः टीएनएफ-α जैसे भड़काऊ साइटोकिन्स को मापकर प्रणालीगत चोट को प्रदर्शित करने के लिए एक बेहतर पद्धति है।
इस आंतों के आईआरआई मॉडल के कई रूपों को वर्षों में विकसित किया गया है। 1990 में, मेगिसन एट अल ने प्रदर्शित किया कि एसएमए के अलावा संपार्श्विक वाहिकाओं को बंद करने से मेसेंटेरिक रक्त प्रवाह में अधिक लगातार कमी आई लेकिन मृत्यु दरमें वृद्धि हुई 33. एक और हाल के अध्ययन से पता चला है कि, अपने आधार पर एसएमए occluding के बदले, बाहर का इलियम में ischemia प्रेरित करने के लिए अपने परिधीय और संपार्श्विक शाखाओं ligating मृत्यु दर34 के बिना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट उपज. स्थानीय धमनी शाखाओं का रोड़ा अधिकतम इस्किमिया सुनिश्चित करता है और एसएमए को अपने आधार पर लिगेटिंग के साथ देखे गए रक्त प्रवाह के मल्टीफोकल, खंडीय कटौती के मुद्दे को संबोधित कर सकता है। हालांकि आंतों के आईआरआई मॉडलिंग की इस वैकल्पिक विधि में आंतों के आईआरआई के स्थानीय ऊतक प्रभावों में अनुसंधान के लिए आवेदन है, यह अज्ञात है कि क्या यह प्रणालीगत सूजन और बहु-अंग विफलता को सटीक रूप से मॉडल कर सकता है जो आंतों की चोट से जुड़ा हो सकता है।
एसएमए रोड़ा सभी प्रकार के आंतों के आईआरआई के लिए एक उपयुक्त मॉडल नहीं है। उदाहरण के लिए, गैर-ओक्लूसिव मेसेंटेरिक इस्किमिया, कार्डियक आउटपुट में कमी से उपजी स्प्लेनचनिक हाइपोपरफ्यूजन की विशेषता है। इसलिए, इस तकनीक मायोकार्डियल रोधगलन, कंजेस्टिव दिल की विफलता, महाधमनी अपर्याप्तता, या गुर्दे या यकृत रोग35 की वजह से आंतों आईआरआई का अध्ययन करने के लिए इष्टतम नहीं होगा. कोजर एट अल ने बताया कि एसएमए रोड़ा, हालांकि, सदमे36 द्वारा प्रेरित आंत आईआरआई के लिए एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है। हालांकि कम किफायती, सूअरों जैसी अन्य प्रजातियों के उपयोग से कुछ आंतों की चोट की स्थिति के मॉडलिंग के लिए कृन्तकों पर लाभ हो सकता है। 2014 में गोंजालेज एट अल द्वारा एक व्यापक समीक्षा वर्तमान में आंतों आईआरआई9 की जांच के लिए उपयोग में पशु मॉडल का वर्णन करती है।
अपनी सीमाओं के बावजूद, इसके आधार पर एसएमए occluding की तकनीक आंतों ischemia9 के सबसे अधिक इस्तेमाल कृंतक मॉडल में से एक बनी हुई है. चूंकि इसके लिए केवल एक संवहनी क्लैंप और एक बुनियादी सेटअप की आवश्यकता होती है, इसलिए सर्जरी अपने आप में काफी सरल है। यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट भी पैदा करता है, जैसा कि यहां प्रस्तुत आंकड़ों से स्पष्ट है। कृन्तकों में एसएमए रोड़ा आंतों के आईआरआई के रोड़ा कारणों को मज़बूती से मॉडल कर सकता है और पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा दोनों में व्यावहारिक अनुप्रयोग हो सकता है। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि हमने यहां जिन प्रक्रियाओं को रेखांकित किया है, उन्हें निरंतरता के साथ किया जाए।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के इंट्राम्यूरल रिसर्च डिवीजन द्वारा प्रदान किया गया था।
हम डॉ. जेम्स हॉकिन्स को उनकी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम बेहतर मेसेंटेरिक धमनी का पता लगाने में उनकी सहायता के लिए डॉ. मिहाई ओल्टियन और रॉबर्ट लिनफोर्ड को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान अपनी विशेषज्ञता प्रदान करने के लिए डॉ. पेट्रीसिया कार्वाल्हो ओबेद एलरिच, क्लाउडियो कोरिया नतालिनी और जॉर्ज हॉवेल III को अपना धन्यवाद देना चाहते हैं। अंत में, हम स्टीफन विंकोविच को इस पेपर में दिखाए गए सुंदर फोटोमाइक्रोग्राफ प्राप्त करने में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं और डॉ. एलिसिया ओलिवियर को अंतिम आंकड़ों को लेबल करने और प्रस्तुत करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |