Vi beskriver hvordan man kan generere en mye brukt kirurgisk modell av intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) hos gnagere. Prosedyren innebærer okklusjon av den øvre mesenteriske arterien etterfulgt av restaurering av blodstrømmen. Denne modellen er nyttig for studier som undersøker okklusive årsaker til intestinal IRI i både veterinær- og humanmedisin.
Intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er forbundet med en myriade av tilstander i både veterinær- og humanmedisin. Intestinale IRI-forhold, som gastrisk dilatasjonsvolvulus (GDV), mesenterisk torsjon og kolikk, observeres hos dyr som hunder og hester. En første avbrudd av blodstrømmen fører til at vev blir iskemisk. Selv om det er nødvendig for å berge levedyktig vev, kan etterfølgende reperfusjon indusere ytterligere skade. Hovedmekanismen som er ansvarlig for IRI er dannelse av frie radikaler ved reperfusjon og gjeninnføring av oksygen i skadet vev, men det er mange andre komponenter involvert. De resulterende lokale og systemiske effektene gir ofte en dårlig prognose.
Intestinal IRI har vært gjenstand for omfattende forskning de siste 50 årene. En in vivo gnagermodell der basen av arteria mesenterica superior (SMA) er midlertidig ligert, er for tiden den vanligste metoden som brukes til å studere intestinal IRI. Her beskriver vi en modell av intestinal IRI som benytter isoflurananestesi i 21%O2 medisinsk luft som gir reproduserbar skade, som demonstrert ved konsistent histopatologi i tynntarmen. Vevsskade ble også vurdert i tykktarm, lever og nyrer.
Iskemi-reperfusjonsskade (IRI) kan forekomme i et hvilket som helst organ og involverer to sekvensielle komponenter. En innledende opphør av blodstrømmen fører til at berørte vev blir iskemiske, og deretter induserer etterfølgende reperfusjon ytterligere celleskade. Skader fra reperfusjonen overstiger ofte det som skyldes iskemi1. Patofysiologien til IRI innebærer en kompleks kaskade av hendelser, hvorav den mest bemerkelsesverdige er dannelse av frie radikaler ved gjeninnføring av oksygen, som oppstår under reperfusjon2. Aktivering av inflammatoriske celler og cytokiner spiller også en rolle2. Ved intestinal IRI kan bakteriell translokasjon i blodet etter endotelskade føre til systemisk inflammatorisk responssyndrom2. Hvis skaden på grunn av IRI er alvorlig nok, kan resulterende systemiske effekter føre til multiorgansvikt3.
Tilfeller av intestinal IRI er assosiert med høy morbiditet og dødelighet 4,5,6. Intestinal IRI er forbundet med mange patologiske tilstander og kirurgiske prosedyrer i både veterinær- og humanmedisin. I veterinærmedisin er dyr spesielt utsatt for intestinale IRI-tilstander, som gastrisk dilatasjonsvolvulus (GDV), mesenterisk torsjon og kolikk 7,8. Hos mennesker er IRI et stort og hyppig forekommende problem ved abdominal aortaaneurismekirurgi, strangulert brokk, akutt mesenterisk iskemi, volvulus, traume, sjokk, neonatal nekrotiserende enterokolitt og tarmreseksjon eller transplantasjon9.
De fleste in vivo gnagerstudier av intestinal IRI involverer okklusjon av basen av den øvre mesenteriske arterien (SMA), grenen av abdominal aorta som leverer blod til flertallet av tynntarmen og den proksimale delen av tykktarmen 10,11,12. Til tross for denne modellens utbredte bruk og relative enkelhet, er det ikke publisert en detaljert protokoll som bruker inhalasjonsbedøvelse i 21 %O2 medisinsk luft. Mangelen på en standardprotokoll utgjør vanskeligheter for forskere som ikke er kjent med prosedyren og forhindrer konsistens på tvers av studier. Vi demonstrerer trinnene som er nødvendige for å gjennomføre den kirurgiske modellen av intestinal IRI hos 8-14 uker gamle mannlige og kvinnelige sveitsiske Webster-mus. Denne modellen av intestinal IRI gir reproduserbar skade, som demonstrert ved konsistent histopatologi.
Til tross for den utbredte bruken av denne intestinale IRI-modellen, er den ikke uten begrensninger. For eksempel, eneste okklusjon av bare basen av SMA ikke helt hindre blodstrømmen til tarmen. Dette skyldes sannsynligvis omfattende sikkerhetssirkulasjon i mesenteriet, som kan trekke blod fra nærliggende grener av abdominal aorta. I en studie hos katter reduserte SMA-okklusjon blodstrømmen med 35 % i proksimale tolvfingertarmen, 61 % i distale tolvfingertarmen, 71 % i jejunum og ileum og 63 % i proksimale colon. Blodgjennomstrømningen ble ikke redusert i midtre og distale colon, som får mye av sin sirkulasjon fra a. mesenterica inferior23. Hos gnagere er jejunum og ileum oftest oppgitt som de tarmsegmentene som medfører størst vevsskade etter SMA-okklusjon9.
Et bredt spekter av iskemitider etter SMA-okklusjon har blitt sitert i litteraturen, fra 1 til 90 min eller mer. Ulike iskemiske tider resulterer i forskjellige nivåer av reperfusjonsskade; Park et al. observerte reperfusjonsskade når det iskemiske intervallet var mellom 40 og 60 min, men ikke når det iskemiske intervallet var kortere eller lengre24. Slike resultater tyder på at kortere tider ikke gir nok iskemi til å fremkalle reperfusjonsskade, mens lengre tider skader vevet så alvorlig at det er umulig å påvise reperfusjonsskaden som følger. I tillegg bærer lengre iskemiske tider risikoen for økt dødelighet. Som vist i vår studie døde 50% (3/6) av de første musene som gjennomgikk 60 min iskemi etter bare 90 minutters reperfusjon. Forkortelse av iskemitiden til 45 minutter senket dødeligheten til 20% (1/5) uten å endre vevsskadeskårene. Basert på vår studie, ser det ut til at det ideelle vinduet for iskemisk skade kan oppnås ved SMA okklusjon i ca 45 min.
En annen variabel er reperfusjonstiden før vevssamling. Som med iskemitider, varierer reperfusjonstidene mye på tvers av studier, fra 60 minutter til over 24 timer. Flere artikler har rapportert at tarmslimhinnen medfører maksimal morfologisk skade ved 2 til 3 timers reperfusjon, med fullstendig reparasjon oppnådd ved 24 timer 25,26,27. Oppsamling av vev før dette 2 til 3 timers vinduet risikerer ikke å fange opp hele omfanget av reperfusjonsskaden, mens vev høstet nærmere 24 timer allerede har startet reparasjonsprosessen. Vi valgte først en reperfusjonstid på 120 min, men endret deretter til 90 min i et forsøk på å redusere dødeligheten. Denne endringen endret ikke vevsskaderesultatene, noe som tyder på at et avvik på 30 minutter fra 2 til 3 timers vinduet er akseptabelt.
Oksygenkonsentrasjon er også en viktig variabel i utviklingen av IRI. Wilding et al. fant at, sammenlignet med mus som fikk 21%O2, opplevde de bedøvede med isofluran levert med 100% O2 ventilasjon-perfusjonsfeil på grunn av atelektase. I samme studie utviklet rotter som fikk 100% O2 akutt respiratorisk acidose og forhøyet gjennomsnittlig arterielt trykk28. Slike fysiologiske endringer unngås best når man induserer en skade som IRI, der en rekke systemiske faktorer er involvert. Dermed synes 21% O2 å være mer hensiktsmessig enn 100% O2 som bærergass for isofluran levering.
Bruken av heparin i denne protokollen er åpen for debatt. Heparin er kjent for å ha antikoagulative og antiinflammatoriske effekter29. Vi fant at endring fra 60 min iskemi og 120 min reperfusjon til 45 min iskemi og 90 min reperfusjon med 400 IE/kg heparin ikke endret mikroskopisk tarmskade, men reduserte mortalitet. En mulig forklaring er at heparin forhindret dødelig tromboembolisme til fjerne organer som lunger og hjerne, men vi fant ikke holdepunkter for dette på nekropsi ved grov eller mikroskopisk undersøkelse av de to første musene som døde. Bruk av kortere iskemi og reperfusjonstider uten heparin kan være like effektivt for å redusere dødeligheten. Hvis det var tilfelle, ville det være klokt å avstå fra bruk av heparin for å minimere interferens med IRI. Imidlertid kan det være aktuelt å inkludere heparin i protokollen for de som ønsker å modellere kirurgiske årsaker til IRI, da kirurgiske pasienter ofte får heparin perioperativt.
Isofluran er vist å ha vevsbeskyttende effekt ved tarmbetennelse og iskemi, og bruken kan interferere med en klinisk relevant IRI-modell 30,31,32. Imidlertid er organofluorinhalanter (dvs. isofluran, sevofluran) ofte brukt anestetika i både veterinær- og humanmedisin. I tillegg overstiger anestesilengden som kreves for denne protokollen 120 minutter, og dermed er et sniffestoff mer hensiktsmessig enn en korttidsvirkende injeksjon som må doseres på nytt.
Ingen mikroskopiske lesjoner var tilstede i proksimale colon, lever eller nyre. Mangelen på mikroskopiske forandringer skyldtes kanskje den relativt korte reperfusjonstiden på 90 til 120 minutter. I tillegg har den proksimale kolon blodtilførsel fra den nedre mesenteriske arterien. Mangel på synlig skade utelukker imidlertid ikke systemisk skade. Revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) er sannsynligvis en bedre metode for å demonstrere systemisk skade ved å måle inflammatoriske cytokiner som TNF-α.
Flere varianter av denne intestinale IRI-modellen har blitt utviklet gjennom årene. I 1990 viste Megison et al. at okkludering av sikkerhetsfartøy i tillegg til SMA ga en mer konsistent reduksjon av mesenterisk blodstrøm, men en økning i dødeligheten33. En nyere studie viste at i stedet for å okkludere SMA ved basen, ga ligering av perifere og sikkerhetsgrener for å indusere iskemi i distal ileum reproduserbar skade uten dødelighet34. Okklusjon av de lokale arterielle grener sikrer maksimal iskemi og kan løse problemet med multifokale, segmentelle reduksjoner av blodstrømmen sett med ligering av SMA bare ved basen. Mens denne alternative metoden for modellering av intestinal IRI har søknad om forskning på lokale vevseffekter av intestinal IRI, er det ukjent om det nøyaktig kan modellere systemisk betennelse og multiorgansvikt som kan være forbundet med tarmskade.
SMA okklusjon er ikke en passende modell for alle typer intestinal IRI. Ikke-okklusiv mesenterisk iskemi, for eksempel, er preget av splanknisk hypoperfusjon som stammer fra redusert hjerteutgang. Derfor ville denne teknikken ikke være optimal for å studere intestinal IRI forårsaket av hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, aortainsuffisiens eller nyre- eller leversykdom35. Kozar et al. rapporterte at SMA-okklusjon imidlertid er en klinisk relevant modell for tarm-IRI indusert av sjokk36. Selv om det er mindre økonomisk, kan bruk av andre arter som griser ha fordeler over gnagere for modellering av visse tarmskadeforhold. En omfattende gjennomgang av Gonzalez et al. i 2014 beskriver dyremodeller som for tiden er i bruk for å undersøke intestinal IRI9.
Til tross for begrensningene er teknikken for å okkludere SMA ved basen fortsatt en av de mest brukte gnagermodellene av intestinal iskemi9. Siden det bare krever en vaskulær klemme og et grunnleggende oppsett, er selve operasjonen ganske enkel. Det gir også reproduserbar skade, som det fremgår av dataene som presenteres her. SMA okklusjon hos gnagere kan pålitelig modellere okklusive årsaker til intestinal IRI og kan ha praktisk anvendelse i både veterinær og humanmedisin. Som sådan er det viktig at prosedyrene vi har skissert her, utføres med konsistens.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering for dette prosjektet ble gitt av Divisjon for intramural forskning ved National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health.
Vi vil gjerne takke Dr. James Hawkins for hans mentorskap og støtte. Vi takker også Dr. Mihai Oltean og Robert Linford for deres hjelp med å lokalisere arteria mesenterica superior. Vi ønsker å takke Dr. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini og George Howell III for å gi sin ekspertise under utviklingen av denne protokollen. Til slutt vil vi takke Stephen Wincovitch for hans hjelp med å skaffe de vakre fotomikrografene som er omtalt i denne artikkelen, og Dr. Alicia Olivier for hennes hjelp til å merke og gjengi de endelige tallene.
Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |