Denne protokol beskriver en procedure til udførelse af fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi (FSEC) på membranproteiner for at vurdere deres kvalitet til downstream funktionel og strukturel analyse. Repræsentative FSEC-resultater indsamlet for flere G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) under vaskemiddelopløselige og vaskemiddelfrie forhold præsenteres.
Under membranproteinstrukturel belysning og biofysisk karakterisering er det almindeligt at prøve adskillige proteinkonstruktioner, der indeholder forskellige tags, trunkeringer, deletioner, indsættelser af fusionspartnere og stabiliserende mutationer for at finde en, der ikke er aggregeret efter ekstraktion fra membranen. Desuden er bufferscreening for at bestemme vaskemidlet, additivet, liganden eller polymeren, der giver den mest stabiliserende tilstand for membranproteinet, en vigtig praksis. Den tidlige karakterisering af membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi giver et kraftfuldt værktøj til at vurdere og rangordne forskellige konstruktioner eller betingelser uden krav om proteinoprensning, og dette værktøj minimerer også prøvekravet. Membranproteinerne skal mærkes fluorescerende, almindeligvis ved at udtrykke dem med et GFP-mærke eller lignende. Proteinet kan opløses direkte fra hele celler og derefter groft afklares ved centrifugering; Derefter overføres proteinet ned i en størrelsesudelukkelseskolonne, og der opsamles et fluorescerende spor. Her præsenteres en metode til kørsel af FSEC og repræsentative FSEC-data på GPCR-målene sphingosin-1-phosphatreceptor (S1PR1) og serotoninreceptor (5HT2AR).
Størrelseseksklusionskromatografi (SEC), også kendt som gelfiltreringskromatografi, anvendes almindeligvis i proteinvidenskab1. Under SEC adskilles proteiner baseret på deres hydrodynamiske radius, som er en funktion af proteinstørrelsen og formen2. Kort fortalt opnås denne adskillelse ved at anvende proteinprøverne under flow på et pakket leje af porøse perler, der fungerer som en molekylær sigte. De anvendte perler er ofte tværbundet agarose med et defineret interval af porestørrelser, så proteiner enten kan trænge ind i eller udelukkes fra porerne i perlerne 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiske radier tilbringer en større andel af tiden i porerne og strømmer således langsommere gennem det pakkede leje, mens større proteiner tilbringer en større andel af tiden uden for perlerne (det ekskluderede volumen) og bevæger sig hurtigere gennem det pakkede leje. SEC kan bruges som et proteinrensningstrin, når der anvendes en præparativ søjle1. Når der anvendes en analytisk kolonne, kan SEC bruges til at analysere proteinkvaliteten og egenskaberne2. For eksempel har proteinaggregater, der kan være til stede i en prøve og indikerer protein af dårlig kvalitet, tendens til at være meget store, hvilket betyder, at de kun rejser i det udelukkede volumen og således elueres fra kolonnen tidligst muligt; Dette volumen kaldes kolonnens ugyldige eller ugyldige volumen. Desuden kan molekylvægtstandarder bruges til at kalibrere søjlen, hvilket gør det muligt at interpolere en estimeret molekylvægt af det pågældende protein fra en standardkurve.
Typisk anvendes proteinabsorbansen ved 280 nm til at overvåge proteinelueringen fra en størrelseseksklusionskolonne. Dette begrænser brugen af SEC som analyseværktøj, indtil proteinet af interesse stort set er fri for forurenende proteiner, for eksempel i det sidste trin af proteinrensning. Imidlertid bruger fluorescerende SEC (FSEC) et protein af interesse, der er fluorescerende mærket. Derfor kan et fluorescerende signal bruges til specifikt at overvåge elueringen af proteinet af interesse i tilstedeværelsen af andre proteiner eller endda råblandinger 8,9. Da fluorescerende signaler desuden er meget følsomme, kan en vellykket analyse udføres på prøver med ekstremt lave proteinmængder. Proteinet af interesse er ofte fluorescerende mærket ved at inkludere et grønt fluorescerende protein (GFP) eller forbedret GFP (eGFP) tag i ekspressionskonstruktionen. Det fluorescerende signal kan derefter overvåges ved excitation ved 395 nm eller 488 nm og detektere fluorescerende emission ved 509 nm eller 507 nm for henholdsvis GFP eller eGFP10.
Fordelen ved at bruge et fluorescerende signal til at overvåge proteineluering fra en SEC-søjle gør FSEC til et værdifuldt værktøj til analyse af membranproteinprøver, når ekspressionsniveauerne er særligt dårlige sammenlignet med opløselige proteiner. Det afgørende er, at membranproteiners kvalitet og egenskaber kan analyseres direkte efter opløselighed fra rålysater uden krav om at optimere rensningsprocessen først11,12. Af disse grunde kan FSEC bruges til hurtigt at analysere membranproteinkvaliteten, mens man udforsker de forskellige faktorer, der kan være nødvendige for at forbedre membranproteinets opførsel i opløsningen. For eksempel er det almindeligt at prøve adskillige konstruktioner, der indeholder forskellige tags, trunkeringer, deletioner, indsættelser af fusionspartnere og stabiliserende mutationer for at finde en, der ikke aggregeres efter ekstraktion fra membranen13,14. Desuden kan bufferscreening for at bestemme vaskemidlet, additivet, liganden eller polymeren, der giver den mest stabiliserende tilstand for membranproteinet, definere den bedste buffersammensætning til proteinrensning eller til at tilvejebringe stabilitet til downstream-anvendelser, såsom biofysiske assays eller strukturel karakterisering.
Det overordnede mål med FSEC-metoden er således at indsamle en SEC-søjleelueringsprofil for et målmembranprotein af interesse. Da fluorescens anvendes, indsamles dette SEC-spor desuden så tidligt som muligt i optimeringen af konstruktionerne og betingelserne forud for enhver langvarig rensning. FSEC-sporet kan bruges som et komparativt værktøj til at bedømme sandsynligheden for succes med at rense et membranprotein med forskellige bufferbetingelser eller membranproteinkonstruktioner. På denne måde kan indsamlingen af FSEC-profiler bruges som en hurtig iterativ proces til at nå frem til optimalt konstruktionsdesign og buffersammensætning, inden der bruges kræfter på at generere de mængder rent protein, der kræves til andre analysemetoder.
De generiske systematiske tilgange til tilstandsscreening med FSEC, der præsenteres her, muliggør hurtig optimering af opløseligheds- og oprensningsparametre til produktion af membranproteiner. Det betyder, at stabile og funktionelt aktive membranproteiner hurtigt kan produceres til biofysiske og strukturelle undersøgelser. Desuden kan FSEC køres ved hjælp af laboratorieudstyr, der sandsynligvis allerede er på plads i membranproteinlaboratorier, og der er således ikke krav om køb af et specialinstrument til at køre analyserne.
Kritiske trin
Den tid, der går mellem opløselighedspunktet fra cellerne i vaskemidlet til det punkt, hvor prøven sendes ned i SEC-kolonnen (trin 2.1.5-3.2.5), er tidskritisk, og der må ikke være pauser mellem disse trin. Alle trin skal udføres ved 4 °C eller på is, og den tid, det tager at udføre disse trin, skal holdes på et minimum. Disse tids- og temperaturbegrænsninger er nødvendige for at registrere FSEC-profilen for membranproteinet før enhver potentiel udfoldelse eller nedbrydning. Efter at membranproteinet er blevet opløseligt, er der større risiko for udfoldelse, aggregering og nedbrydning, selv ved 4 °C. Ideelt set bør alle prøver, for hvilke FSEC-sporene skal sammenlignes, passere SEC-kolonnen i samme tid efter opløselighedstrinnet. I praksis er dette vanskeligt, især hvis prøverne sendes sekventielt ned ad en enkelt kolonne, men det er muligt at indsamle op til fem SEC-spor inden for 3 timer fra hinanden, og inden for denne tidsramme bør der ikke være væsentlig nedbrydning.
Fejlfinding
Hvis der ved udførelsen af FSEC-eksperimentet er lavt eller intet fluorescerende signal, er det muligt, at det pågældende membranprotein ikke har udtrykt den valgte cellelinje, har meget lav ekspression af den valgte cellelinje eller ikke er blevet opløseligt i det valgte vaskemiddel. Hvis prøverne blev fortyndet, før fluorescenssignalet blev opsamlet, og FSEC-sporet blev registreret, ville et simpelt første skridt være at prøve en lavere fortynding eller ingen fortynding af SEC-fraktionerne. Hvis dette stadig ikke giver et fortolkeligt FSEC-spor, skal proteinets ekspression og opløselighed kontrolleres.
Analysen af proteinekspression kan opnås ved at kontrollere prøvens fluorescens efter trin 2.2.2. Hvis der er et meget lavt eller intet fluorescerende signal fra denne prøve (f.eks. et signal meget tæt på baggrunden), er der sandsynligvis et problem med proteinekspressionen. Der kan tages skridt til at forbedre ekspressionsniveauerne for membranproteinet, såsom at skifte til en alternativ cellelinje eller justere vækstbetingelserne, induktionen af ekspression og tiden mellem induktion / infektion / transfektion og høsten. Imidlertid kan især dårlig proteinekspression indikere et ustabilt membranprotein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Hvis ekspressionen er blevet kontrolleret, og der er et klart fluorescerende signal over baggrunden før FSEC, kan opløselighedseffektiviteten kontrolleres ved at måle prøvens resterende fluorescerende signal efter trin 2.4.3 (opløseligt membranprotein) sammenlignet med prøven efter trin 2.2.2 (total protein). Det er almindeligt, at opløselighedseffektiviteten er 20% -30% og stadig muliggør en vellykket analyse og oprensning af membranproteinet. Men hvis opløselighedseffektiviteten er mindre end 20%, kan det være nødvendigt med et andet rengøringsmiddel til opløselighed eller forskellige opløselighedsbetingelser. Hvis forsøg på at forbedre opløseligheden ikke lykkes, kan dette indikere et særligt ustabilt membranprotein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Hvis der observeres en meget sen elueringstop i FSEC-sporet (f.eks. 18-24 ml), indikerer dette, at det fluorescerende protein har en proteinmolekylvægt, der er meget lavere end forventet. Dette kan skyldes, at membranproteinet af interesse nedbrydes, hvilket resulterer i “fri” GFP. Man bør kontrollere, om proteinet er intakt før og efter opløselighed ved hjælp af in-gel GFP-fluorescens. Hvis proteinet af interesse synes at være nedbrydende eller proteolyseret, kan mængden af proteasehæmmer øges to gange til fire gange. Imidlertid kan en høj følsomhed over for proteaser eller nedbrudt protein, selv før opløselighed, indikere et særligt ustabilt protein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Ændringer og yderligere anvendelser af FSEC
Almindeligvis er det fluorescerende mærke, der bruges i FSEC, GFP eller eGFP, som beskrevet i denne protokol. Der findes dog mange forskellige fluorescerende proteinmærker. Valget af det fluorescerende mærke, der skal bruges, afhænger af at have en pladelæser, der kan opnå de korrekte excitations- og emissionsparametre til registrering af fluorescerende signal for det valgte fluorescerende mærke og have en fluorofor med ringe eller ingen ændring i kvanteudbytte under forskellige miljøforhold. Desuden er FSEC ikke begrænset til fluorescerende proteiner, men kan også fungere lige så godt med et protein, der er mærket med et fluorescerende farvestof. For eksempel kunne et NTA-farvestof anvendes, hvilket med fordel ville binde til histidinmærkede membranproteinkonstruktioner. Desuden kan enten et fluorescerende mærket antistof, der er kemisk mærket med et fluorescerende farvestof og specifikt til binding af membranproteinet af interesse, eller et oprensningsmærke inkluderet i membranproteinkonstruktionen indirekte mærke et mål for FSEC.
Når der udføres screening af vaskemiddel ved hjælp af FSEC, kan der træffes et valg om, hvorvidt bufferen, der bruges til at køre SEC-kolonnen, skal indeholde det matchende vaskemiddel, som proteinet er opløseligt i, eller om der skal bruges et standardvaskemiddel på tværs af alle kørsler. En mere nøjagtig repræsentation af proteinets opførsel opnås, hvis hele eksperimentet udføres med det matchende vaskemiddel hele vejen igennem. Det kan dog være tidskrævende og spild af vaskemiddel, hvis søjlen skal genbalanceres i et nyt vaskemiddel, før hver kørsel udføres. Da hovedformålet med screening af vaskemidler desuden er at sammenligne spor, vil tendenserne forblive i sporene, selvom forholdene ikke er ideelle. Således kan der opnås et kompromis, hvor proteinet opløses i det relevante vaskemiddel, men søjlen køres i en standardbuffer med et enkelt vaskemiddel på tværs af alle kørsler (f.eks. DDM)11, hvilket kan spare tid og forbrugsstoffer til vaskemiddel.
Ved at ændre det anvendte FLPC-udstyr kan gennemstrømningen af FSEC-protokollen øges betydeligt, og prøvekravet kan minimeres. For eksempel kan et FPLC- eller HPLC-system udstyres med en autosampler, en mindre bedvolumenanalysekolonne (såsom en 3,2 ml analytisk SEC-kolonne) og en in-line fluorescerende detektor til overvågning af kontinuerlige FSEC-spor direkte fra søjlen. Den resulterende opsætning vil gøre det muligt at udføre flere FSEC-kørsler på kortere tid og fjerne det manuelle plotningstrin, hvilket gør det muligt at teste et større antal betingelser inden for en kortere tidsramme. Desuden vil prøvekravet blive yderligere reduceret, da færre prøver vil skulle forberedes og indlæses på FSEC-kolonnen for hver kørsel. Dette ville åbne muligheder for at reducere ekspressionskulturerne til et pladebaseret format, da der ville være behov for så lidt materiale til analysen.
FSEC’s styrker og svagheder sammenlignet med andre metoder
En ulempe ved FSEC er, at membranproteinkonstruktionerne skal designes til at introducere den fluorescerende etiket, og ved introduktion er der en lille mulighed for, at placeringen af etiketten kan forstyrre funktionen eller foldningen af membranproteinet af interesse. Derudover overvåger FSEC-protokollen, som beskrevet her, egenskaberne ved et membranprotein i nærvær af cellelysat, som er en rå blanding af proteiner. Opførelsen af et membranprotein i dette miljø kan være anderledes end når membranproteinet af interesse udsættes for en præparativ SEC-søjle ved afslutningen af oprensningen, når den er fuldt isoleret fra andre proteiner. Desuden giver FSEC et noget kvalitativt mål for proteinkvalitet. Ved at konvertere FSEC-sporet til et monodispersitetsindeks som beskrevet i trin 4.3.3 i protokollen kan der imidlertid opnås et kvantitativt mål for proteinkvaliteten.
FSEC er ikke den eneste metode, der kan bruges i den tidlige analyse af membranproteinkonstruktioner, opløselighedsbetingelser og oprensningsbuffersammensætning. De alternative tilgange har både fordele og ulemper i forhold til FSEC. For eksempel findes fluoroforbaserede termostabilitetsassays, især brugen af farvestoffet 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM)16,17. Fordelen ved denne metode er, at termostabilitetsassays i modsætning til FSEC, som giver et kvalitativt mål for proteinkvalitet, giver et kvantitativt mål i form af en relativ smeltetemperatur. Desuden er der ikke noget krav om at indføre et fluorescerende mærke på proteinkonstruktionen. Ulemperne ved termostabilitetsassays sammenlignet med FSEC er imidlertid, at renset protein skal anvendes, og at analysen ikke er kompatibel med alle proteinkonstruktioner, da den er afhængig af de fordelagtige positioner af indfødte cysteinrester i det foldede protein.
En anden metode, der har ligheder med både FSEC- og fluoroforbaserede termostabilitetsassays, er et assay, der måler temperaturfølsomheden af et membranprotein. I dette assay udfordres proteinet med forskellige temperaturer, og proteinet, der forbliver i opløsning efter centrifugering, detekteres. Detektion i denne metode er blevet udført på flere måder, herunder måling af fluorescensen i opløsning18, fluorescensen af et SDS-PAGE gelbånd19 eller signalintensiteten i en western blot20. En væsentlig ulempe ved disse tilgange er imidlertid, at analysen er meget arbejdskrævende og tilbøjelig til høj støj i resultaterne, da hvert enkelt temperaturpunkt skal indsamles uafhængigt.
Endelig kan flere mere avancerede biofysiske teknikker bruges til at vurdere membranproteinkvalitet på samme måde som FSEC, for eksempel flowinduceret dispersionsanalyse21, mikroskala termoforese22 eller SPR. Selv om disse metoder er meget effektive, er ulempen ved disse metoder kravet om, at højt specialiserede instrumenter skal køre analyserne.
Afslutningsvis giver FSEC et uvurderligt værktøj til brug i membranproteinproduktionskampagner, og selvom det ikke er den eneste mulighed, har det flere forskellige fordele i forhold til andre metoder, som anført ovenfor. Krydsvalidering af resultaterne ved ortogonale assays anbefales altid, og ingen af de ovenfor beskrevne metoder udelukker hinanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke hele Peak Proteins teamet for hjælp og støtte. Fra cellevidenskabsteamet vil vi gerne anerkende Ian Hampton for hans værdifulde indsigt og vejledning i insektcelleekspression. Vi vil gerne takke Mark Abbott for at give ressourcerne og muligheden for at forfølge dette projekt.
1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |