मानव माइक्रोग्लिया जैसी कोशिकाएं: मानव सिनैप्टोसोम का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और इन विट्रो लाइव-सेल फागोसाइटोसिस परख से भेदभाव
Summary
यह प्रोटोकॉल इन विट्रो प्रयोग के लिए माइक्रोग्लिया जैसी कोशिकाओं में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की भेदभाव प्रक्रिया का वर्णन करता है। हम आईपीएससी-व्युत्पन्न निचले मोटर न्यूरॉन्स से मानव सिनैप्टोसोम उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया भी शामिल करते हैं जिसे लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके इन विट्रो फागोसाइटोसिस परख के लिए सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
माइक्रोग्लिया माइलॉयड मूल की निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट में होमियोस्टैसिस को बनाए रखती हैं और कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी बन गई हैं। स्वास्थ्य और बीमारी में मानव माइक्रोग्लिया का अध्ययन मानव कोशिकाओं की अत्यंत सीमित आपूर्ति के कारण एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। मानव व्यक्तियों से प्राप्त प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग इस बाधा को दरकिनार करने के लिए किया जा सकता है। यहां, यह प्रदर्शित किया गया है कि इन विट्रो प्रयोग के लिए माइक्रोग्लिया जैसी कोशिकाओं (आईएमजी) में मानव आईपीएससी को कैसे अलग किया जाए। ये आईएमजी माइक्रोग्लिया के अपेक्षित और शारीरिक गुणों को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें माइक्रोग्लिया जैसी आकृति विज्ञान, उचित मार्करों की अभिव्यक्ति और सक्रिय फागोसाइटोसिस शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न निचले मोटर न्यूरॉन्स (आई3एलएमएन) से प्राप्त सिनैप्टोसोम सब्सट्रेट्स को अलग करने और लेबल करने के लिए प्रलेखन प्रदान किया गया है। एक लाइव-सेल, अनुदैर्ध्य इमेजिंग परख का उपयोग पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल किए गए मानव सिनैप्टोसोम के आवरण की निगरानी के लिए किया जाता है, जिससे आईएमजी की फागोसाइटिक क्षमता की जांच की अनुमति मिलती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मोटे तौर पर विभिन्न क्षेत्रों पर लागू होते हैं जो मानव माइक्रोग्लिया जीव विज्ञान और बीमारी में माइक्रोग्लिया के योगदान की जांच कर रहे हैं।
Introduction
माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं और सीएनएस को विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। होमोस्टेसिस को बनाए रखने और आघात और रोग प्रक्रियाओं के लिए सक्रिय रूप से प्रतिक्रिया देने के लिए वयस्क मस्तिष्क में माइक्रोग्लिया भी महत्वपूर्ण हैं। संचयी साक्ष्य से पता चलता है कि माइक्रोग्लिया कई न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में महत्वपूर्ण योगदानकर्ता हैं। यद्यपि माइक्रोग्लियल जीव विज्ञान के बारे में वर्तमान ज्ञान मुख्य रूप से माउस मॉडल से प्राप्त किया गया है, हाल के अध्ययनों ने म्यूरिन और मानव माइक्रोग्लिया के बीच महत्वपूर्ण अंतर को स्पष्ट किया है, जो मानव माइक्रोग्लिया 3,4 के आनुवंशिकी और जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए विकासशील प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता को रेखांकित करता है। विच्छेदित प्राथमिक ऊतक से माइक्रोग्लिया का अलगाव माइक्रोग्लिया गुणों को गंभीर रूप से संशोधित कर सकता है5, संभावित रूप से ऐसी कोशिकाओं के साथ प्राप्त परिणाम। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य मानव आईपीएससी को आईएमजी में अलग करना है, जिससे बेसल परिस्थितियों में मानव माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के लिए एक सेल कल्चर सिस्टम प्रदान किया जा सके। इसके अलावा, पूरी तरह से मानव मॉडल प्रणाली का उपयोग करके एक फागोसाइटोसिस परख को आईएमजी की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के साधन के रूप में शामिल किया गया है, दोनों गुणवत्ता नियंत्रण उपाय के रूप में और बीमारी के संदर्भ में आईएमजी शिथिलता का आकलन करने के लिए।
आईपीएससी से माइक्रोग्लिया भेदभाव के लिए कई प्रोटोकॉल हाल ही मेंसाहित्य 6,7,8,9,10 में उभरे हैं। कुछ प्रोटोकॉल के संभावित नुकसान में भेदभाव की विस्तारित या लंबी अवधि, कई विकास कारकों को जोड़ना, और / या जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं 6,9,10 शामिल हैं। यहां, एक “उपयोगकर्ता के अनुकूल” भेदभाव विधि का प्रदर्शन किया गया है जो प्रारंभिक मैक्रोफेज अग्रदूतों (पीएमपी) 7,11 नामक अग्रदूत कोशिकाओं में आईपीएससी के भेदभाव के माध्यम से माइक्रोग्लिया ऑन्टोजेनी के पहलुओं को पुन: परिभाषित करता है। पीएमपी पहले वर्णित के रूप में उत्पन्न होते हैं, जिसमें कुछ अनुकूलन यहांप्रस्तुत किए गए हैं। पीएमपी एमवाईबी-स्वतंत्र जर्दी-थैली-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की नकल करते हैं, जो रक्त-मस्तिष्क बाधा बंद होने से पहले मस्तिष्क पर आक्रमण करके भ्रूण के विकास के दौरान माइक्रोग्लिया को जन्म देतेहैं। पीएमपी को आईएमजी में अंतिम रूप से अलग करने के लिए, हमने हेनसेलर एट अल और ब्राउनजॉन एट अल द्वारा प्रोटोकॉल के आधार पर एक तेज और सरलीकृत मोनोकल्चर विधि का उपयोग किया, जिसमें एक कुशल माइक्रोग्लिया भेदभाव विधि उत्पन्न करने के लिए कुछ संशोधन किए गए, जिसमें आईएमजी माइक्रोग्लिया-समृद्ध मार्कर 7,8 को मजबूती से व्यक्त करते हैं। इस विभेदन विधि को आईपीएससी की संस्कृति में विशेषज्ञता के साथ प्रयोगशालाओं में पुन: प्रस्तुत किया जा सकता है और मानव मॉडल प्रणाली का उपयोग करके माइक्रोग्लिया जीव विज्ञान का अध्ययन करने के उद्देश्य से अनुसंधान लक्ष्यों के साथ।
आईपीएससी-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया इन विट्रो प्रयोग के लिए मानव माइक्रोग्लिया के जैविक रूप से प्रासंगिक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं और फागोसाइटोसिस सहित माइक्रोग्लियल कैननिकल कार्यों की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। माइक्रोग्लिया मस्तिष्क और सीएनएस के पेशेवर फागोसाइट्स हैं, जहां वे सेल मलबे, समेकित प्रोटीन और अवक्रमित माइलिन14 को साफ करते हैं। माइक्रोग्लिया सिनैप्टिक रीमॉडेलिंग में सिनेप्स को घेरकर और रोगजनकों के फागोसाइटोसिस के माध्यम से बाहरीसंक्रमणों के खिलाफ रक्षा में भी कार्य करता है। इस प्रोटोकॉल में, आईएमजी द्वारा फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन मानव सिनैप्टोसोम का उपयोग करके आईएमजी को घेरने के लिए सामग्री के रूप में किया जाता है। इसके लिए, मानव आई3एलएमएन से प्राप्त सिनैप्टोसोम को अलग करने के लिए एक विवरण वर्णित है। आई3एलएमएन-व्युत्पन्न मानव सिनैप्टोसोम को पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल किया जाता है जो विट्रो में फागोसोम प्रसंस्करण और गिरावट के दौरान अम्लीय डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत सिनैप्टोसोम की मात्रा का परिमाणीकरण करने की अनुमति देता है। लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक फागोसाइटोसिस परख वास्तविक समय में माइक्रोग्लिया घेरने की गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए दिखाया गया है। यह कार्यात्मक परख एक पूर्ण मानव प्रणाली का उपयोग करके स्वास्थ्य और बीमारी में माइक्रोग्लियल फागोसाइटोसिस में संभावित दोषों की जांच करने के लिए एक आधार स्थापित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता के साथ ~ 6-8 सप्ताह में आईपीएससी-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया जैसी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों और अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने मोटर न्यूरॉन भेदभाव के लिए डब्ल्यूटीसी 11 एचएनआईएल आईपीएससी लाइन प्रदान करने के लिए माइकल वार्ड और माइक्रोग्लिया भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले कोएलएफ 2.1 जे डब्ल्यूटी क्लोन बी 03 आईपीएससी लाइन की आपूर्ति के लिए जैक्सन प्रयोगशालाओं को धन्यवाद दिया। हम प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के दौरान उनके समर्थन के लिए डोरोथी शेफर, लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम के साथ उनकी मदद के लिए एंथनी गिएमपेट्रूज़ी और जॉन लैंडर्स के साथ-साथ संशोधन के दौरान उनके तकनीकी योगदान के लिए हेडन गेड और इस अध्ययन में उनके सहयोग के लिए जोनाथन जंग को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएमएएसएस चैन मेडिकल स्कूल और एंजेल फंड, इंक से न्यूरोसाइंस के लिए डैन और डायने रिक्सियो फंड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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