संपर्क अतिसंवेदनशीलता (सीएचएस) एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन (एसीडी) का एक प्रयोगात्मक मॉडल है। सीएचएस छाती और पेट की मुंडा त्वचा को चित्रित करके प्रतिक्रियाशील हैप्टेन के साथ संवेदीकरण पर आधारित है, बाद में एक पतला हैप्टेन के साथ कान की त्वचा की चुनौती के साथ, सूजन प्रतिक्रिया का कारण बनता है जिसका विभिन्न तरीकों से मूल्यांकन किया जाता है।
संपर्क अतिसंवेदनशीलता (सीएचएस) एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन (एसीडी) का एक प्रयोगात्मक मॉडल है जिसका अध्ययन चूहों में किया जा सकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक उद्देश्य प्रयोगशाला विधि प्रस्तुत करना है जो चूहों में सीएचएस प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में मदद कर सकता है, जिसे विभिन्न परीक्षणों द्वारा मापा और परिमाणित किया जा सकता है। सीएचएस को प्रेरित करने के लिए, दिन “0” पर, चूहों को एसीटोन-इथेनॉल मिश्रण में हैप्टेन 2,4,6-ट्रिनिट्रोक्लोरोबेंजीन (टीएनसीबी) के साथ पेट की त्वचा पेंटिंग द्वारा पहले से मुंडा स्थान पर संवेदनशील बनाया गया था, जबकि नकारात्मक नियंत्रण चूहों को वाहन अकेले-एसीटोन-इथेनॉल मिश्रण के साथ संवेदनशील बनाया गया था। दिन “4” पर, आधारभूत कान की मोटाई को परीक्षण और नियंत्रण समूहों दोनों में पतला टीएनसीबी के साथ दोनों कानों को चित्रित करके सीएचएस (चुनौती) की प्राप्ति से पहले एक माइक्रोमीटर के साथ मापा गया था। 24 घंटे के बाद, कान की सूजन को माइक्रोमीटर के साथ मापा गया था। सीएचएस एक टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक उदाहरण है जो सूजन वाले ऊतक में सूजन का कारण बनता है, एक ही हैप्टेन के साथ त्वचा की चुनौती के बाद 24 घंटे तक पहुंच जाता है। संवर्धित कान के वजन, मायलोपरोक्सीडेज (एमपीओ) गतिविधि, कान के अर्क में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन एकाग्रता, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा में एडिमेटस डर्मिस के मोटा होने में वृद्धि और कान संवहनी पारगम्यता के साथ सहसंबद्ध कान की सूजन में वृद्धि। नियंत्रण चूहों की तुलना में परीक्षण समूह के सीरा में टीएनपी-विशिष्ट आईजीजी 1 एंटीबॉडी की एकाग्रता में भी वृद्धि हुई थी। इसके अतिरिक्त, सीएचएस को पहले टीएनसीबी के साथ संवेदनशील दाताओं से प्राप्त सीएचएस-प्रभावक कोशिकाओं के साथ सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया जा सकता है। सीएचएस-इफेक्टर कोशिकाओं को भोले प्राप्तकर्ता चूहों में अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया गया था, जिन्हें बाद में उसी पतला हैप्टेन के साथ चुनौती दी गई थी। कान की सूजन को 24 घंटे बाद माइक्रोमीटर से मापा गया।
एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन (एसीडी) औद्योगिक देशों में एक सामान्य त्वचा भड़काऊ बीमारी है जो हैप्टेंस नामक कम आणविक भार रसायनों के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप टाइप IV अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया के कारण होती है। मनुष्यों में संपर्क संवेदीकरण पैदा करने वाले पदार्थों में भारी धातु आयन (क्रोमियम, निकल, लोहा, कोबाल्ट), तारपीन, सुगंध, रंजक और सौंदर्य प्रसाधनों में मौजूद संरक्षक (जैसे, पी-फेनिलेनेडियामाइन), कुछ दवाएं (जैसे, नियोमाइसिन, बेंजोकेन), β-लैक्टम एंटीबायोटिक्स (यानी, पेनिसिलिन), पौधों द्वारा उत्पादित रसायन (पेंटाडेका) शामिल हैं . एसीडी एटिओलॉजिकल एजेंट बहुत अधिक हैं क्योंकि अकेले उद्योग में 100,000 से अधिक रसायनों का उपयोग किया जाता है, और हर साल 2,000 नए संश्लेषित होते हैं। आज तक, 3,700 से अधिक अणुओं की पहचान की गई है जो संपर्क हैप्टेंस / एलर्जी हो सकते हैं3. संपर्क अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया (सीएचएस) एसीडी का एक प्रयोगात्मक मॉडल है जिसका अध्ययन चूहों, गिनी सूअरों और चूहों में किया जा सकता है और कार्बनिक सॉल्वैंट्स 4,5,6 में भंग प्रतिक्रियाशील रासायनिक हैप्टेंस के सामयिक त्वचा अनुप्रयोग से प्रेरित किया जा सकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक उद्देश्य प्रयोगशाला पद्धति का वर्णन करना है जो चूहों में सीएचएस प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में मदद कर सकता है, जिसे विभिन्न परीक्षणों द्वारा मापा और परिमाणित किया जा सकता है।
सीएचएस में संवेदीकरण (प्रेरण) और प्रभावक (चुनौती) चरण होते हैं। पशु मॉडल में, हैप्टेंस पहले नियोएंटिजन बनाने के लिए शरीर में प्रोटीन के लिए सहसंयोजक रूप से बांधते हैं। संवेदीकरण चरण के दौरान, सक्रिय केराटिनोसाइट्स प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स-ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (टीएनएफ-α) और इंटरल्यूकिन 1β (आईएल -1β)7 का उत्पादन करके त्वचा डेंड्राइटिक कोशिकाओं (एसडीसी) के प्रवास और परिपक्वता को बढ़ावा देते हैं। एपिडर्मल लैंगरहैंस कोशिकाएं (एलसी) सीएचएस प्रेरण और प्रभावक चरणों 8 के दौरान एंटीजन पेश करतीहैं। संवेदीकरण के दौरान हैप्टेन के संपर्क में आने वाले एलसी नियामक और प्रभावकारी कोशिकाओं दोनों के प्रेरण को बढ़ावादेते हैं 9. कई अध्ययनों से बढ़ते सबूत बताते हैं कि सीएचएस प्रतिक्रियाओं को सीडी 4 + एमएचसी कक्षा द्वितीय-प्रतिबंधित टीएच 1 कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, स्थानीय रूप से इंटरफेरॉन-γ (आईएफएन-γ) को एक विशिष्ट भड़काऊ घुसपैठ, सीडी 8 + एमएचसी वर्ग I-प्रतिबंधित टीसी 1 लिम्फोसाइटों को नियोजित करने के लिए जारी किया जा सकता है जो आईएफएन-γ भी जारी कर सकते हैं लेकिन ज्यादातर केराटिनोसाइट्स को साइटोटॉक्सिक क्षति की मध्यस्थता कर सकते हैं, और अब इंटरल्यूकिन भी 17 (आईएल -17) 11.
विभिन्न प्रजातियों को नियोजित करने वाले कई अलग-अलग सीएचएस मॉडल1 2,13,14 और हैप्टेंस विकसित किए गए हैं (विभिन्न हैप्टेंस, सॉल्वैंट्स और आवेदन के समय की विस्तृत तुलना तालिका 1 में संक्षेप में दी गई है)। माउस, अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली प्रयोगशाला प्रजाति, सीएचएस का अध्ययन करने में कुछ फायदे प्रदान करती है। अन्य प्रजातियों की तुलना में चूहों के बीच अधिक उपभेद, नॉकआउट (केओ), और ट्रांसजेनिक जानवर हैं, जो उन्हें एक बहुत ही आकर्षक जानवर बनाता है15. इसके अलावा, सीएचएस मॉडल को कई जानवरों की आवश्यकता होती है, और चूहे यहां अधिक किफायती होते हैं। पशु मॉडल सभी पहलुओं में एसीडी की नकल नहीं करते हैं; विशेष रूप से, वे क्रस्टिंग और डिस्क्वामेशन दिखाते हैं, जो मनुष्यों के लिए आम नहीं है16,17. पुरानी बीमारी की विशेषताएं प्रजनन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, मुख्यतः क्योंकि वर्णित मॉडल लंबे समय तक हैप्टेन के आवेदन को नहीं मानता है। हालांकि, यहां यह पुष्टि की गई है कि एसीडी के कई महत्वपूर्ण पहलुओं को पुन: पेश किया जाता है। यह भी दिखाया गया है कि, मनुष्यों की तरह, ये विशेषताएं स्थानीय एलर्जी प्रतिक्रियाओं से जुड़ी हैं। हैप्टेन की पसंद, इसके विलायक, और इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित इसके आवेदन को इस तथ्य से निर्धारित किया गया था कि परिणामों की पुष्टि कई इन विट्रो परीक्षणों द्वारा की गई है और वर्तमान संस्करण स्थापित होने तक कई वर्षों तक प्रयोगशाला में इसका परीक्षण और संशोधन किया गया था। म्यूरिन मॉडल सेल सबसेट या साइटोकिन्स के विश्लेषण की अनुमति देते हैं जो एसीडी के विकास में शामिल हैं और नए उपचारों के प्रीक्लिनिकल आकलन के लिए आवश्यक हैं।
सीएचएस को हैप्टेंस के माध्यम से प्रेरित किया जाता है, जो त्वचा में स्व-प्रोटीन एंटीजन से बंधता है, जिससे नियोएंटिजन बनते हैं। सीएचएस को एंटीजन-विशिष्ट सीएचएस-इफेक्टर टी कोशिकाओं को परिचालित करने क?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को सबवेंशन सब्वेशन सब्ज़ द्वारा समर्थित किया गया था। व्रोकला, पोलैंड में मेडिकल यूनिवर्सिटी के ए020.22.060, और विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय एन एन 401 545940 से एमएस और आईपी 2012 0443 72 से एमएमएस तक अनुदान द्वारा।
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |