Kontaktöverkänslighet (CHS) är en murin experimentell modell av allergisk kontaktdermatit (ACD). CHS bygger på sensibilisering med reaktiv hapten genom att måla den rakade huden på bröstet och buken, med en efterföljande öronhudsutmaning med en utspädd hapten, vilket orsakar en svullnadsreaktion som bedöms på olika sätt.
Kontaktöverkänslighet (CHS) är en experimentell modell av allergisk kontaktdermatit (ACD) som kan studeras hos möss. Denna studie syftar till att presentera en objektiv laboratoriemetod som kan hjälpa till att studera CHS-reaktionen hos möss, som kan mätas och kvantifieras med olika tester. För att inducera CHS, på dag “0”, sensibiliserades möss på en tidigare rakad plats genom bukhudmålning med hapten 2,4,6-trinitroklorbensen (TNCB) i en aceton-etanolblandning, medan negativa kontrollmöss var bluffsensibiliserade med fordonets enda-aceton-etanolblandning. På dag “4” mättes baslinjens örontjocklek med en mikrometer före elicitering av CHS (utmaning) genom att måla båda öronen med utspädd TNCB både i test- och kontrollgrupperna. Efter 24 h mättes öronsvullnaden med en mikrometer. CHS är ett exempel på ett T-cellsmedierat immunsvar som orsakar svullnad i inflammerad vävnad, som toppar 24 timmar efter hudutmaningen med samma hapten. En ökning av öronödem korrelerat med ökad öronvikt, myeloperoxidas (MPO) aktivitet, proinflammatorisk cytokinkoncentration i öronextrakten, ökad förtjockning av edematös dermis i den histologiska undersökningen och öron vaskulär permeabilitet. Det fanns också en ökning av koncentrationen av TNP-specifika IgG1-antikroppar i serum i testgruppen jämfört med kontrollmössen. Dessutom kan CHS framgångsrikt överföras med CHS-effektorceller erhållna från givare som tidigare sensibiliserats med TNCB. CHS-effektorcellerna administrerades intravenöst till naiva mottagarmöss, som därefter utmanades med samma utspädda hapten. Öronsvullnad mättes med en mikrometer 24 timmar senare.
Allergisk kontaktdermatit (ACD) är en vanlig hudinflammatorisk sjukdom i industrialiserade länder orsakad av en överkänslighetsreaktion av typ IV till följd av exponering för kemikalier med låg molekylvikt som kallas haptens. De ämnen som orsakar kontaktsensibilisering hos människor inkluderar tungmetalljoner (krom, nickel, järn, kobolt), terpentin, dofter, färgämnen och konserveringsmedel som finns i kosmetika (t.ex. p-fenylendiamin), vissa läkemedel (t.ex. neomycin, bensokain), β-laktamantibiotika (dvs penicillin), kemikalier som produceras av växter (pentadekatekol, ett ämne som finns i giftig murgröna), samt hydrokinon som används i fotografisk industri 1,2 . ACD-etiologiska medel är mycket höga eftersom över 100 000 kemikalier används bara inom industrin och 2 000 nya syntetiseras varje år. Hittills har mer än 3 700 molekyler identifierats som kan vara kontakthaptens/allergener3. Kontaktöverkänslighetsreaktionen (CHS) är en experimentell modell av ACD som kan studeras hos möss, marsvin och råttor och kan induceras genom topisk hudapplikation av reaktiva kemiska haptens upplösta i organiska lösningsmedel 4,5,6. Denna studie syftar till att beskriva en objektiv laboratoriemetod som kan hjälpa till att studera CHS-reaktionen hos möss, som kan mätas och kvantifieras med olika tester.
CHS består av sensibiliseringsfaser (induktion) och effektorfaser (utmaning). I djurmodeller binder haptens först kovalent till proteiner i kroppen för att skapa neoantigens. Under sensibiliseringsfasen främjar aktiverade keratinocyter migration och mognad av huddendritiska celler (sDC) genom att producera proinflammatoriska cytokiner-tumörnekrosfaktor α (TNF-α) och interleukin 1β (IL-1β)7. Epidermala Langerhans-celler (LCs) presenterar antigener under CHS-induktions- och effektorfaserna8. LCs utsatta för hapten under sensibilisering främjar induktion av både regulatoriska och effektorceller9. Ökande bevis från flera studier tyder på att CHS-svar kan förmedlas av antingen CD4 + MHC klass II-begränsade Th1-celler, som lokalt frigör interferon-γ (IFN-γ) för att använda ett karakteristiskt inflammatoriskt infiltrat, CD8 + MHC klass I-begränsade Tc1-lymfocyter som också kan frigöra IFN-γ men mestadels förmedla cytotoxiska skador på keratinocyter, och nu också interleukin 17 (IL-17) -producerande Th17-celler10, 11.
Flera olika CHS-modeller som använder olika arter1 2,13,14 och haptens har utvecklats (en detaljerad jämförelse av olika haptens, lösningsmedel och appliceringstid sammanfattas i tabell 1). Musen, en ofta använd laboratorieart, erbjuder några fördelar med att studera CHS. Det finns fler stammar, knockouts (KO) och transgena djur bland möss jämfört med andra arter, vilket gör dem till ett mycket attraktivt djur15. Dessutom kräver CHS-modellen många djur, och möss är mer ekonomiska här. Djurmodeller efterliknar inte ACD i alla aspekter; i synnerhet visar de skorpbildning och desquamation, vilket inte är vanligt för människor 16,17. Egenskaperna hos kronisk sjukdom är utmanande att reproducera, främst för att den beskrivna modellen inte antar appliceringen av hapten under en lång tidsperiod. Det har dock bekräftats här att många av de väsentliga aspekterna av ACD reproduceras. Det har också visat sig att, som hos människor, är dessa egenskaper förknippade med lokala allergiska reaktioner. Valet av hapten, dess lösningsmedel och dess tillämpning som beskrivs i detta protokoll dikterades av det faktum att resultaten har bekräftats av många in vitro-tester och att det testades och modifierades i laboratoriet i många år tills den nuvarande versionen fastställdes. Murina modeller möjliggör analys av cellundergrupper eller cytokiner som är involverade i utvecklingen av ACD och är väsentliga för prekliniska bedömningar av nya behandlingar.
CHS induceras via haptens, som binder till självproteinantigener i huden, vilket skapar neoantigens. CHS förmedlas av lokal extravaskulär rekrytering av cirkulerande antigenspecifika CHS-effektor T-celler, vilket resulterar i svullnad i den utmanade vävnaden, som toppar 24 timmar efter exponering av sekundärhuden för samma hapten6. Svullnaden i vävnaden orsakas huvudsakligen av infiltration av leukocyter och leukocytberoende fibrinavsättning24. Dessa förä…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av subvention SUBZ. A020.22.060 från Medical University i Wroclaw, Polen, och genom bidrag från ministeriet för vetenskap och högre utbildning N N401 545940 till MS och IP2012 0443 72 till MMS.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |