वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में इंट्राडोडेनल पोषक तत्व ों के इंजेक्शन के जवाब में बहने वाली आंतों के लसीका को अलग करने के लिए एक विस्तृत सर्जिकल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विभिन्न प्रयोगात्मक पोषक तत्वों के जवाब में कुल आंतों के लिपिड अवशोषण और काइलोमाइक्रोन संश्लेषण और स्राव के शारीरिक निर्धारण की अनुमति देता है।
आंतों के लिपोप्रोटीन, विशेष रूप से ट्राइग्लिसराइड युक्त काइलोमाइक्रोन, चयापचय, सूजन और हृदय रोगों का एक प्रमुख चालक हैं। हालांकि, आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करना विवो में बहुत मुश्किल है क्योंकि वे पहले छोटी आंत से मेसेंटेरिक लसीका में स्रावित होते हैं। काइलोमाइक्रोन युक्त लसीका तब वक्ष वाहिनी से उप-लेवियन नस में खाली हो जाता है ताकि भोजन के घटकों को हृदय, फेफड़ों और अंततः, पूरे शरीर के परिसंचरण तक पहुंचाया जा सके। भोले काइलोमाइक्रोन को रक्त से अलग करना असंभव है क्योंकि काइलोमाइक्रोन ट्राइग्लिसराइड परिसंचरण में लिपोप्रोटीन लाइपेस और अन्य लिपोप्रोटीन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत पर तुरंत हाइड्रोलिसिस से गुजरता है। इसलिए, चूहों में बोलमैन एट अल द्वारा वर्णित मूल 2-दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया का उपयोग ऐतिहासिक रूप से वक्ष शिरा में प्रवेश से पहले ताजा मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करने के लिए किया गया है। पिछले 45 वर्षों से पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा उस प्रोटोकॉल में सुधार और पेशेवरीकरण किया गया है, जिससे इन महत्वपूर्ण लिपोप्रोटीन और आंत से स्राव के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। त्सो लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को अब अपडेट किया गया है और पहली बार यहां नेत्रहीन रूप से प्रस्तुत किया गया है। यह संशोधित प्रक्रिया ग्रहणी आहार ट्यूब स्थापित करने, मेसेंटेरिक लिम्फ वाहिनी को नष्ट करने और सचेत चूहों में भोजन के बाद लिम्फ एकत्र करने के लिए एक एकल-दिवसीय शल्य चिकित्सा तकनीक है। इन नई तकनीकों के प्रमुख लाभों में चूहों से लिम्फ एकत्र करने की क्षमता शामिल है (जो आनुवंशिक माउस मॉडल की शक्ति का दोहन करता है); ग्रहणी जलसेक ट्यूब और लिम्फ कैनुला के आरोपण के दौरान चूहों के लिए कम संज्ञाहरण समय; पूरे भोजन और पोस्ट-प्रांडियल अवधि के दौरान लगातार लिम्फ का नमूना लेने की क्षमता; रक्त में उनके कमजोर पड़ने और एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस से पहले हार्मोन और साइटोकिन्स को मात्रात्मक रूप से मापने की क्षमता; और आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करने के लिए बड़ी मात्रा में लिम्फ एकत्र करने की क्षमता। यह तकनीक आहार पोषक तत्व अवशोषण, आंतों के लिपोप्रोटीन संश्लेषण और काइलोमाइक्रोन स्राव को सीधे और मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
मेसेंटेरिक लसीका प्रणाली का शारीरिक महत्व
मेसेंटेरिक लसीका को ~ 300 ईसा पूर्व से किसी न किसी रूप में वर्णित किया गया है जब हेरोफिलोस ने यकृत पोर्टल प्रणाली और आंतों में सभी “अवशोषक नसों” का वर्णन किया 1,2,3,4,5। इस प्रारंभिक विवरण के बाद 1,700 से अधिक वर्षों के लिए, आंतों के लसीका की एक परिभाषितविशेषता भोजन के तुरंत बाद मेसेंटेरिक लिम्फ में दूधिया तरल पदार्थ की उपस्थिति थी। अब यह ज्ञात है कि दूधिया, काइलोमाइक्रोन युक्त लिम्फ (“चिलोस” लिम्फ) पोर्टल नस और यकृत में नहीं निकलता है, बल्कि इसके बजाय सिस्टर्ना काइली के माध्यम से वक्ष वाहिनी में यात्रा करता है और अंततः, बाएं सबक्लेवियन नस 6 पर रक्त में शामिलहो जाता है। इस शारीरिक व्यवस्था के कारण, चिलोस लिम्फ पहले शरीर के बाकी हिस्सों के माध्यम से घूमने से पहले हृदय और फेफड़ों के माध्यम से यात्रा करता है। इसका मतलब यह है कि हृदय और फेफड़ों को मेसेंटेरिक लिम्फ7 में स्राव पर “पहला पास” मिलता है।
मेसेंटेरिक लसीका की एक प्रमुख भूमिका छोटी आंत 8,9,10 से आहार लिपिड का परिवहन है। शारीरिक रूप से, काइलोमाइक्रोन, आंतों की प्रतिरक्षा कोशिकाएं 11,12,13,14, आंत हार्मोन 15,16,17,18, एंटीजन 19,20,21, गैर-काइलोमाइक्रोन लिपोफिलिक यौगिक 22,23 , और अतिरिक्त तरल पदार्थ एंटरोसाइट तहखाने झिल्ली को अंतर्निहित लैक्टियल्स में प्रवेश करता है और फिर लसीका केशिकाओं के माध्यम से मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में केंद्रित होता है। मेटाबोलाइट्स, एंटीजन, पर्यावरणीय संदूषक, पोषक तत्व और सिग्नलिंग अणुओं सहित कई अज्ञात मेसेंटेरिक लसीका घटक होने की संभावना है।
मेसेंटेरिक लिम्फ के घटकों को व्यवस्थित रूप से पहचाना नहीं गया है, मोटे तौर पर मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करने की कठिनाई के कारण। मेसेंटेरिक लिम्फ तक पहुंचना हमेशा एक गंभीर चुनौती रही है क्योंकि लिम्फ नलिकाएं रंगहीन होती हैं, और फैटी भोजन के बाद जब वे चिलौस और दूधिया हो जाते हैं, तो मेसेंटेरिक लसीका में रंगहीन लसीका द्रव 6,8,9,10 होता है।
आंतों के लसीका को अलग करने के लिए वर्तमान और सामान्य तरीके
मेसेंटेरिक लिम्फ को मनुष्यों में एक्सेस नहीं किया जा सकता है (दुर्लभ और चरम परिस्थितियों को छोड़कर जहां गंभीर जीआई आघात हुआ है)24। विवो लिम्फ संग्रह शल्य चिकित्सा से जटिल और मांग है। मूल 2 दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को बोलमैन एट अल .25 द्वारा वर्णित किया गया था और पिछले 45 वर्षों26,27 के लिए पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा सुधार और पेशेवर बनाया गया है। लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया जांचकर्ताओं को 6 घंटे के ग्रहणी लिपिड जलसेक अवधि के दौरान सचेत जानवरों से बहते हुए लिम्फ को इकट्ठा करने की अनुमति देती है।
लिम्फ फिस्टुला मॉडल का उपयोग मुख्य रूप से चूहों में लिम्फ प्रवाह दर, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल (या अन्य ग्रहणी-संक्रमित यौगिकों), काइलोमाइक्रोन संरचना और आंतों के हार्मोन सांद्रता को मापने के लिए किया गया है। कुछ हद तक, इस तकनीक का उपयोग चूहों में भी किया जा सकता है, हालांकि सर्जिकल अस्तित्व और लिम्फ की मात्रा पीड़ित है। मेसेंटेरिक लिम्फ नलिकाओं को देखने में कठिनाइयों के कारण, ऐतिहासिक तरीकों में मिनी-सूअर28, भेड़29, सूअर30, कुत्ते31 और चूहों17 जैसे बड़े जानवरों में मेसेंटेरिक लिम्फ शामिल हैं। इन बड़े मॉडलों के साथ काम करना संसाधन गहन है और नॉक-इन या नॉक-आउट मॉडल में अध्ययन की अनुमति नहीं देता है।
वैकल्पिक दृष्टिकोण का भी उपयोग किया गया है। काइलोमाइक्रोन को पोस्ट-प्रांडियल अवस्था में रक्त से अलग किया जा सकता है (हालांकि इन्हें प्लाज्मा लिपोप्रोटीन लाइपेस द्वारा आंशिक रूप से हाइड्रोलाइज्ड किया जाएगा) 32,33,34,35। थोरैसिक वाहिनी को भी कैनुला किया जा सकता है, हालांकि वहां एकत्र किए गए लिम्फ में मेसेंटेरिक लिम्फ और अतिरिक्त आंतों के लिम्फ जल निकासी26,36 का मिश्रण होता है। विट्रो में, कैको -2 कोशिकाएं फैटी एसिड उपचार के जवाब में एक काइलोमाइक्रोन जैसे कण का स्राव करती हैं, और इन कोशिकाओं को प्रासंगिक लसीका एंडोथेलियल या संवहनी कोशिकाओं37,38 के साथ सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है। मानव और माउस आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को एपिकल लिपिड को संसाधित करने और काइलोमाइक्रोन 39,40,41,42 का स्राव करने के लिए दिखाया गया है। ये मॉडल अत्यधिक लाभप्रद हैं और छोटी आंतों के शरीर विज्ञान में यंत्रवत अंतर्दृष्टि को सक्षम करते हैं, लेकिन वे जटिलता, फिजियो-रासायनिक ग्रेडिएंट, या सीटू मेसेंटेरिक लसीका के गतिशील लिम्फ प्रवाह को दोहरा नहीं सकते हैं।
यहां प्रस्तुत 1 दिन माउस लिम्फ फिस्टुला मॉडल के लाभ
आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करने के इन अन्य तरीकों के संबंध में, त्सो लैब लिम्फ फिस्टुला तकनीक को पारंपरिक रूप से मेसेंटेरिक लिम्फ में आहार पोषक तत्वों के अवशोषण को मापने के लिए स्वर्ण-मानक तकनीक माना जाता है। विवो तकनीक में यह आहार लिपिड अवशोषण के प्रमुख शारीरिक पहलुओं को पकड़ने का लाभ है- अवशोषण अवधि में यौगिकों की गतिशील उपस्थिति, जिसके लिए ग्रहणी पोषक तत्वों के साथ जीवित जानवरों में बहने वाले मेसेंटेरिक लिम्फ के बार-बार नमूने की आवश्यकता होती है। यह सर्जिकल तकनीक रक्त के बजाय सीधे अपने शारीरिक डिब्बे में आंत हार्मोन और साइटोकिन्स को मापती है, जहां वे पतला और एंजाइमेटिक रूप से अवक्रमितहोते हैं।
यदि प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए लिपिड स्राव गतिशीलता या किसी भी हाइड्रोफोबिक जीआई यौगिक या दवा के गतिशील अवशोषण और चयापचय की समझ की आवश्यकता होती है, तो यह तकनीक न केवल उपयुक्त है, बल्कि एकमात्र दृष्टिकोण भी है जो समीपस्थ से डिस्टल आंत (पेट से बृहदान्त्र) और एपिकल से बेसोलेटरल सतह तक ल्यूमिनल सामग्री के आंदोलन को इंटरपोलेट करता है (एंटरोसाइट से लैक्टेल्स और पोर्टल परिसंचरण के माध्यम से ल्यूमिनल सामग्री)। चूंकि यह तकनीक इंट्राडोडेनल कैथेटर के माध्यम से पोषक तत्वों के ल्यूमिनल वितरण को नियोजित करती है, और क्योंकि बहने वाले मेसेन्टेरिक लिम्फ को मोड़ दिया जाता है और एकत्र किया जाता है, पूरा अवशोषण तंत्र प्रयोगात्मक नियंत्रण में है और इसका उपयोग गुणात्मक रूप से छोटे आंतों के अवशोषण प्रोफाइल का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
पहली बार यहां नेत्रहीन रूप से प्रस्तुत त्सो लैब लिम्फ फिस्टुला मॉडल का एक प्रमुख अपडेट है, जो (1) प्रयोगात्मक समय को 1 दिन के सर्जिकल आरोपण और प्रयोगात्मक संग्रह अवधि तक कम कर देता है; (2) माउस अस्तित्व और पशु कल्याण विचारों में सुधार; और (3) माउस आनुवंशिक मॉडल की शक्ति का दोहन करने के लिए चूहों में दृष्टिकोण की प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है। इस तकनीक को आंतों के स्राव, लिपोप्रोटीन, या आहार लिपिड अवशोषण के सभी प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए एक स्वर्ण मानक माना जाना चाहिए और लिपिड अवशोषण कैनेटीक्स और काइलोमाइक्रोन के उच्च निष्ठा निर्धारण के लिए सबसे अच्छी तकनीक है।
मूल 2 दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को बोलमैन एट अल .25 द्वारा वर्णित किया गया था और पिछले 45 वर्षों से पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा अभ्यास किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटी आंत के अद्वितीय चिलोस स्राव की पहचान, मात्रा और समझने के लिए इस क्लासिक, सोने-मानक विधि के साथ-साथ आहार पोषक तत्व अवशोषण और चयापचय, आंत हार्मोन और आंतों की प्रतिरक्षा की विवो गतिशीलता के लिए एक शक्तिशाली अतिरिक्त है।
इस मॉडल के फायदों में (1) अवशोषण, पाचन या स्राव के दौरान एक समय बिंदु पर स्थिर नमूनाकरण के बजाय फीडिंग और पोस्ट-प्रांडियल अवधि के दौरान मेसेंटेरिक लिम्फ का लगातार नमूना लेने की क्षमता शामिल है; (2) आंत हार्मोन और साइटोकिन्स का माप रक्त के बजाय सीधे उनके शारीरिक डिब्बे में होता है, जहां वे पतला और एंजाइमेटिक रूप से अवक्रमितहोते हैं 17,44; (3) लिपिड भोजन के अंतर्ग्रहण और मेसेंटेरिक लिम्फ में एंडोथेलियल लाइपेस की अनुपस्थिति के बाद छोटी आंत द्वारा स्रावित लिपोप्रोटीन को अलग करने, मात्रा निर्धारित करने और चिह्नित करने की क्षमता, जो काइलोमाइक्रोन ट्राइग्लिसराइड सांद्रता और देशी काइलोमाइक्रोन संरचना46,47 को संरक्षित करता है; (4) सीधे लिम्फ प्रवाह दर, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल (या अन्य ग्रहणी-संक्रमित यौगिकों), काइलोमाइक्रोन संरचना और आंतों के हार्मोन सांद्रता के उत्पादन को मापने की क्षमता। अंत में, यह प्रोटोकॉल 6 घंटे की अवधि में हर घंटे >50 μL लिम्फ की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा एकत्र करने की अनुमति देता है। चूंकि तरल पदार्थ को इंट्रा-डुओडेनल खारा और ग्लूकोज जलसेक के साथ फिर से भर दिया जाता है, इसलिए लिम्फ फिस्टुला मॉडल को अन्य लिम्फ नमूना तकनीकों पर काफी सुधार हुआ है और इसके परिणामस्वरूप मेसेंटेरिक लिम्फ के स्थिर पूल के बजाय प्रवाह होता है। चूंकि मात्रा लिपिडोमिक, प्रोटिओमिक और मेटाबोलिक दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख बाधा है, यह एक प्रमुख ताकत है।
यहां वर्णित 1 दिवसीय माउस लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल में मूल लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, जिसमें सर्जरी के बाद उच्च जीवित रहने की दर के कारण पहले वर्णित 2 दिन के लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल 26,27 से कुल प्रयोगात्मक पशु संख्या में कमी शामिल है; समग्र प्रयोगात्मक समय में 2 दिनों से एक दिन तक की कमी; और, अंत में, चूहों के लिए वसूली अवधि में रात भर (>18 घंटे) की कमी, जहां सफलता का दर्द या खराब पोस्ट-सर्जिकल परिणाम हो सकते हैं, सर्जरी के बाद की अवधि में अधिक प्रबंधनीय ~ 6 घंटे।
इस 1 दिवसीय प्रोटोकॉल की एक विशेषता मानवीय विचारों और समापन बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करना है। इन्हें सर्वोच्च प्राथमिकता लेनी चाहिए: (1) जानवरों को इंट्राडोडेनल या आईवी प्रतिस्थापन तरल पदार्थ प्राप्त करना चाहिए; (2) उन्हें गर्म और जितना संभव हो उतना दर्द मुक्त रखा जाना चाहिए (पोस्ट-ऑपरेटिव बुप्रेनेक्स और / या कारप्रोफेन के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन और विरोधी भड़काऊ प्रभावों से बचने की आवश्यकता पर निर्भर करता है); (3) रक्तस्राव, झटकों, दस्त, या संकट के संकेत सभी मानवीय समापन बिंदु के लिए सम्मोहक कारण हैं। सख्त आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफ्लुरेन एक अच्छा समापन बिंदु है। सर्जिकल जीवित रहने की दर एक दिन के लिए ~ 70% है (मूल 2 दिन की सर्जरी के लिए ~ 40% की तुलना में), लेकिन जांचकर्ताओं को संकट के संकेत पर प्रयोग को समाप्त करने में संकोच नहीं करना चाहिए। पशु संख्या की योजना बनाते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए।
इस तकनीक के समस्या निवारण के संदर्भ में, लिम्फ कैनुला का सफल प्लेसमेंट इस शल्य चिकित्सा प्रक्रिया में प्रमुख बाधा है। सर्जरी का अभ्यास करते समय, यह सर्जरी से लगभग 2 घंटे पहले माउस को 0.3 एमएल जैतून के तेल के साथ गैवेज करने में मदद करता है। यह मेसेंटेरिक लिम्फ डक्ट में काइलोमाइक्रोन के स्राव का कारण बनेगा, जिससे यह “दूधिया” और अधिक दृश्यमान दिखाई देगा। मेथिलीन ब्लू का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन अक्सर दूधिया लिम्फ वाहिनी की तुलना में कम स्पष्ट होता है। यदि लिम्फ कैनुला के प्लेसमेंट और गोंद के साथ इसके प्लेसमेंट के बाद मेसेंटेरिक लिम्फ सफलतापूर्वक कैनुला के माध्यम से एक संग्रह पोत में बह रहा है, तो कोई ग्रहणी जलसेक ट्यूब के प्लेसमेंट के साथ आगे बढ़ सकता है। कभी-कभी, लसीका लगातार प्रवाहित नहीं हो सकता है लेकिन जब जानवर को घूर्णन तालिका पर रखा जाता है तो फिर से बहना शुरू हो सकता है। गंभीर रूप से, लिम्फ ट्यूबिंग के भीतर थक्कों के लिए देखें। लिम्फ डक्ट पर बैकफ्लो दबाव को रोकने के लिए इन्हें ट्यूबों से बाहर मालिश की जानी चाहिए।
ट्राइग्लिसराइड स्राव और लिम्फ प्रवाह दर के अलावा, इस तकनीक का उपयोग निम्नलिखित लिपिड अवशोषण कैनेटीक्स और काइलोमाइक्रोन विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है:
काइलोमाइक्रोन स्राव 45,48,49
वसा युक्त भोजन के तुरंत बाद, प्लाज्मा ट्राइग्लिसराइड को प्रसारित करने में क्षणिक वृद्धि होती है। चूंकि ट्राइग्लिसराइड्स स्वाभाविक रूप से हाइड्रोफोबिक हैं, इसलिए उन्हें पहले रक्त50 में घुलनशील होने के लिए इमल्सीफाइड किया जाना चाहिए। छोटे आंतों के एंटरोसाइट्स इस भूमिका को पूरा करते हैं और आहार ट्राइग्लिसराइड को काइलोमाइक्रोन इमल्शनकणों में पैकेज करते हैं। काइलोमाइक्रोन में उनके कोर में कोलेस्ट्रॉल और आहार ट्राइग्लिसराइड होता है, जो फॉस्फोलिपिड्स और एपोलिपोप्रोटीन से घिरा होता है, जिसमें एपीओबी -48, एपीओए-आई, एपीओए-IV और एपीओसी -3 52,53,54,55 शामिल हैं। एपीओबी -48 आवश्यक संरचनात्मक प्रोटीन है, और अन्य एपोलिपोप्रोटीन में काइलोमाइक्रोन चयापचय और रक्त से निकासी के लिए आवश्यक विभिन्न कार्य हैं। काइलोमाइक्रोन की प्रमुख विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए, उनके ट्राइग्लिसराइड और एपोलिपोप्रोटीन सामग्री सहित, यहां दिखाए गए 1 दिन की लिम्फ फिस्टुला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। काइलोमाइक्रोन स्राव दर संक्रमित 3एच-ट्राइग्लिसराइड का प्रतिशत है जो लिम्फ में स्रावित होता है और प्रति घंटा लिम्फ नमूनों की गिनती करके सिंटिलेशन द्वारा मापा जाता है। इसे विस्तृत काइलोमाइक्रोन लक्षण वर्णन 48,49,56,57,58 के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रति घंटा लिम्फ नमूने को जोड़ा जा सकता है या अलग रखा जा सकता है। लिम्फ को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है, 0.9% एनएसीएल के साथ मिलाया जाता है, और फिर 0.87% एनएसीएल के 300-500 μL के साथ सावधानीपूर्वक ओवरलेड किया जाता है। नमूने तब 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 x g पर अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूज किए जाते हैं। पृथक काइलोमाइक्रोन युक्त शीर्ष अंशों को ट्राइग्लिसराइड परख किट का उपयोग करके ट्राइग्लिसराइड सांद्रता के लिए एकत्र और परीक्षण किया जाता है। संक्षेप में, काइलोमाइक्रोन (1: 10 तनुकरण) के 2 μL को 96-वेल प्लेट में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 μL एंजाइम अभिकर्मक के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। प्लेट को 500 एनएम पर एक प्लेट रीडर द्वारा पढ़ा जाता है, और ट्राइग्लिसराइड सांद्रता की गणना के लिए मानकों और रिक्त स्थान का उपयोग किया जाता है। काइलोमाइक्रोन आकार तब नकारात्मक धुंधलापन और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 14,29 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल को एलिसा किट या वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा रासायनिक परख और एपोलिपोप्रोटीन सामग्री (एपीओबी -48, ए-आई, सी-2, सी-III) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
लिपिड अवशोषण की प्राथमिक साइट का निर्धारण48,59
3एच-ट्राइग्लिसराइड या रेडियो-लेबल मिश्रित भोजन के जलसेक के बाद 6 घंटे में ग्रहणी, जेजुनम और इलियम के ल्यूमिनल और एपिथेलियल सेल डिब्बों को अलग करके, सामग्री को यह निर्धारित करने के लिए निकाला जाता है कि 3एच-ट्राइग्लिसराइड का कितना हिस्सा उपकला कोशिका झिल्ली (सामान्य) में अवशोषित होता है या छोटी आंत48 की लंबाई के साथ लुमेन (असामान्य) में बरकरार रहता है। . ये अध्ययन विशेष रूप से प्रभावशाली हैं यदि जीआई गतिशीलता60,61,62 में संभावित अंतर हैं, यदि पित्त एसिड (लिपिड अवशोषण के दौरान अत्यधिक सक्रिय और स्वयं इलियम में पुन: अवशोषित) के बारे में एक परिकल्पना है) 63,64,65,66, या यदि चिंता है कि पोषक तत्व गलत शारीरिक स्थान (इलियम या यहां तक कि बृहदान्त्र) में अवशोषित हो रहे हैं। 68,69,70.
अवशोषक उपकला कोशिकाओं में 3 एच-ट्राइग्लिसराइड तस्करी के तंत्र की पहचान करना 48
यह आंतों के लुमेन में 3एच-ट्राइग्लिसराइड हाइड्रोलाइज्ड से 3एच-फ्री फैटी एसिड के प्रतिशत की गणना करके किया जाता है, म्यूकोसा में अवशोषित होता है, और काइलोमाइक्रोन के रूप में स्राव से पहले इंट्रासेल्युलर 3एच-ट्राइग्लिसराइड में फिर से एस्टरिफाइड होता है। स्राव दोषों का यह एक शक्तिशाली मार्कर है क्योंकि इसे इसके टूटने वाले उत्पादों में आहार ट्राइग्लिसराइड की गति और बाद में काइलोमाइक्रोन में पैकेजिंग दिखाने के लिए पता लगाया जा सकता है। फैटी एसिड अवशोषण मशीनरी (सीडी 36, एफएबीपी, एसीएसएल), पुन: एस्टरीफिकेशन मार्ग (एमजीएटी, डीजीएटी, एमटीटीपी, एपीओबी), और एपोलिपोप्रोटीन (एपीओसी -3, बी -48, सी -2, ए -1, ए -4) की एमआरएनए अभिव्यक्ति को आरटी-पीसीआर द्वारा आगे मात्रात्मक किया जा सकता है।
इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोग केवल आंत-अंग क्रॉसटॉक, चयापचय, प्रतिरक्षा, पोषक तत्व अवशोषण, पर्यावरणीय आहार संदूषक, या जीआई प्रणाली में भूमिका के साथ किसी अन्य बीमारी में रुचि से सीमित हैं। यह संभावना है कि महत्वपूर्ण मेसेंटेरिक लिम्फ सिस्टम तक पहुंचने में कठिनाई के कारण कई सम्मोहक प्रयोगों और परिकल्पनाओं को रोक दिया गया है, और इस विज़ुअलाइज़ किए गए प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस तकनीक को अधिक आसानी से उपलब्ध कराना है। काइलोमाइक्रोन और मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करना जिसमें वे शुरू में रहते हैं, पूरे शरीर के चयापचय को समझने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है; 1 दिन माउस लिम्फ फिस्टुला मॉडल इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली शारीरिक मॉडल है।
The authors have nothing to disclose.
हम इन अध्ययनों के समर्थन के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (पायलट और व्यवहार्यता पुरस्कार 1810, एबीके), रेनिन फाउंडेशन (सिनर्जी अवार्ड, पीआई जीजे रैंडोल्फ और को-आई एबीके), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर01डीके118239, आर03डीके116011 से एबीके) के लिए बेहद आभारी हैं।
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |