本プロトコールは、マウスにおける十二指腸内栄養注入に応答して流れる腸リンパを単離するための詳細な外科プロトコールを記載する。これにより、様々な実験栄養素に応答した総腸脂質吸収およびカイロミクロン合成および分泌の生理学的決定が可能になる。
腸内リポタンパク質、特にトリグリセリドが豊富なカイロミクロンは、代謝、炎症、および心血管疾患の主要な推進力です。しかし、腸内リポ蛋白はまず小腸から腸間膜リンパ管に分泌されるため、 生体内での 単離は非常に困難です。次に、カイロミクロンを含むリンパ液が胸管から鎖骨下静脈に空になり、食事の成分を心臓、肺、そして最終的には全身循環に届けます。カイロミクロントリグリセリドは、循環中のリポタンパク質リパーゼおよび他のリポタンパク質受容体との相互作用直後に加水分解を受けるため、ナイーブカイロミクロンを血液から単離することは不可能です。したがって、ラットでBollmanらによって記述された元の2日間のリンパ瘻手順は、胸部静脈に入る前に新鮮な腸間膜リンパを分離するために歴史的に使用されてきました。.このプロトコルは、過去45年間、Patrick Tsoの研究室によって改善され、専門化されており、これらの重要なリポタンパク質と腸からの分泌物の分析を可能にしています。Tsoリンパ瘻の手順が更新され、ここで初めて視覚的に提示されます。この改訂手順は、意識のあるマウスで十二指腸栄養チューブを取り付け、腸間膜リンパ管をカニューレ挿入し、食後にリンパを採取するための1日の外科的手法です。これらの新しい技術の主な利点には、マウスからリンパ液を再現的に収集する能力が含まれます(これは遺伝子マウスモデルの力を利用します)。十二指腸注入チューブおよびリンパカニューレの移植中のマウスの麻酔時間の短縮;摂食および食後の期間を通してリンパを継続的にサンプリングする能力。ホルモンおよびサイトカインが血液中で希釈および酵素加水分解される前に定量的に測定する能力。腸内リポタンパク質を単離するために大量のリンパ液を収集する能力。この技術は、食事の栄養素吸収、腸管リポタンパク質合成、およびカイロミクロン分泌を直接かつ定量的に測定するための強力なツールです。
腸間膜リンパ系の生理学的重要性
腸間膜リンパ管は、ヘロフィロスが肝門脈系とすべての「腸内の吸収静脈」を記述した紀元前~300年以来、何らかの形で記載されてきました1,2,3,4,5。この最初の記述から1,700年以上の間、腸リンパ管の決定的な特徴は、食事の直後の腸間膜リンパ液中の乳白色の液体の存在でした3。乳白色のカイロミクロン含有リンパ(「乳び」リンパ)は、門脈や肝臓に排出されず、代わりに精槽乳びを通って胸管に移動し、最終的には左鎖骨下静脈で血液に結合することが知られています6。この解剖学的配置により、乳びリンパは最初に心臓と肺を通って移動し、その後体の残りの部分を循環します。これは、心臓と肺が腸間膜リンパ7への分泌物で「ファーストパス」を得ることを意味します。
腸間膜リンパ管の主な役割は、小腸からの食物脂質の輸送です8,9,10。解剖学的には、カイロミクロン、腸管免疫細胞11,12,13,14、腸内ホルモン15,16,17,18、抗原19,20,21、非カイロミクロン脂溶性化合物22,23、および過剰な液体は、腸球基底膜の下にある乳酸に入り、リンパ毛細血管を通って腸間膜リンパ節に濃縮されます。代謝物、抗原、環境汚染物質、栄養素、シグナル伝達分子など、未知の腸間膜リンパ成分が多数存在する可能性があります。
腸間膜リンパの成分は、主に腸間膜リンパを単離することが困難であるため、体系的に同定されていない。腸間膜リンパ管は無色であり、脂肪の多い食事の後を除いて、乳びで乳白色になるため、腸間膜リンパ管へのアクセスは常に深刻な課題でした6,8,9,10。
腸リンパを分離するための現在および一般的な方法
腸間膜リンパは、ヒトではアクセスできません(深刻なGI外傷が発生したまれで極端な状況を除く)24。生体内リンパ採取は外科的に複雑で要求が厳しいものです。元の2日間のリンパ瘻手順は、Bollmanら25によって記述され、過去45年間、Patrick Tsoの研究室によって改善され、専門化されてきました26,27。リンパ瘻手順により、研究者は意識のある動物から流れるリンパを収集できます 6時間の十二指腸脂質注入期間中。
リンパ瘻モデルは、主にラットでリンパ流量、トリグリセリドとコレステロール(または他の十二指腸注入化合物)の出力、カイロミクロン組成、および腸ホルモン濃度を測定するために使用されてきました。程度は低いですが、この手法はマウスにも使用できますが、外科的生存とリンパ液量が損なわれます。腸間膜リンパ管を見るのが難しいため、歴史的な方法には、ミニブタ28、ヒツジ29、ブタ30、イヌ31、ラット17などの大型動物の腸間膜リンパのカニューレが含まれていました。これらの大規模なモデルでの作業はリソースを大量に消費し、ノックインモデルまたはノックアウトモデルでの研究はできません。
代替アプローチも使用されています。カイロミクロンは、食後の状態の血液から単離することができます(ただし、これらは血漿リポタンパク質リパーゼによって部分的に加水分解されます)32,33,34,35。胸管もカニューレ挿入することができますが、そこに集められたリンパ液には腸間膜リンパと腸外リンパドレナージの混合物が含まれています26,36。インビトロでは、Caco-2細胞は脂肪酸処理に応答してカイロミクロン様粒子を分泌し、これらの細胞は関連するリンパ管内皮細胞または血管細胞と共培養することができる37,38。ヒトおよびマウスの腸管オルガノイド培養は、頂端脂質を処理し、カイロミクロンを分泌することが示されている39,40,41,42。これらのモデルは非常に有利であり、小腸生理学への機構的洞察を可能にしますが、in situ腸間膜リンパ管の複雑さ、物理化学的勾配、または動的リンパ流を再現することはできません。
ここで紹介した1日マウスリンパ瘻モデルの利点
腸内リポタンパク質を単離するこれらの他の方法に関して、Tso Labリンパ瘻法は伝統的に腸間膜リンパへの食事栄養素の吸収を測定するためのゴールドスタンダード技術と考えられてきた。このin vivo技術には、食事性脂質吸収の重要な生理学的側面、つまり吸収期間中の化合物の動的出現を捉えるという利点があり、十二指腸栄養素を含む生きた動物の流れる腸間膜リンパの繰り返しサンプリングが必要です。この外科的手法はまた、腸内ホルモンとサイトカインを血液中ではなく生理学的コンパートメントで直接測定し、そこで希釈して酵素的に分解します17,43。
実験的な質問が脂質分泌動態または疎水性GI化合物または薬物の動的吸収および代謝の理解を必要とする場合、この技術は適切であるだけでなく、近位から遠位腸(胃から結腸)および頂端から基底外側表面への管腔内容物の動きを補間する唯一のアプローチでもあります(管腔内容物から腸細胞を通って乳酸および門脈循環)。この技術は、十二指腸内カテーテルを介した栄養素の管腔送達を採用し、流れる腸間膜リンパを迂回させて収集するため、吸収装置全体が実験的制御下にあり、小腸吸収プロファイルを定性的に評価するために使用できます。
ここで初めて視覚的に提示されるのは、Tso Labリンパ瘻モデルのメジャーアップデートであり、(1)実験時間を1日の外科的移植および実験収集期間に短縮します。(2)マウスの生存率と動物福祉の考慮事項を改善します。(3)マウス遺伝子モデルの力を利用するためのマウスでのアプローチの再現性を高めます。この技術は、腸管分泌物、リポタンパク質、または食事脂質吸収に関するすべての実験的質問のゴールドスタンダードと見なされなければならず、脂質吸収速度論およびカイロミクロンの高忠実度測定のための最良の技術です。
元の2日間のリンパ瘻手順は、Bollmanら25によって記述され、過去45年間Patrick Tsoの研究室によって実践されました26,27。ここで紹介するプロトコルは、小腸の独特の乳び分泌物、および食事栄養素の吸収と代謝、腸ホルモン、腸管免疫のin vivoダイナミクスを識別、定量化、理解するためのこの古典的なゴールドスタンダードの方法への強力な追加です。
このモデルの利点には、(1)吸収、消化、または分泌のいずれかの間のある時点で静的サンプリングではなく、摂食および食後の期間を通じて腸間膜リンパを継続的にサンプリングできることが含まれます。(2)腸内ホルモンおよびサイトカインを血液中ではなく生理学的コンパートメント内で直接測定し、そこで希釈および酵素的に分解する17,44;(3)脂質ミールの摂取および腸間膜リンパ液中の内皮リパーゼの不在後に小腸から分泌されるリポタンパク質を単離、定量、および特徴付ける能力、これはカイロミクロントリグリセリド濃度および天然カイロミクロン構造を維持する46,47;(4)リンパ流量、トリグリセリドとコレステロール(または他の十二指腸注入化合物)の出力、カイロミクロン組成、および腸内ホルモン濃度を直接測定する能力。最後に、このプロトコルにより、6時間にわたって毎時>50μLのリンパ液を比較的大量に収集できます。体液に十二指腸内生理食塩水とブドウ糖注入が補充されるため、リンパ瘻モデルは他のリンパサンプリング技術よりも大幅に改善され、腸間膜リンパの静的プールではなく流動します。体積はリピドミック、プロテオミクス、メタボロームのアプローチにとって大きなハードルであるため、これは大きな強みです。
ここで説明する1日マウスリンパ瘻プロトコルは、手術後の生存率が高いため、前述の2日目のリンパ瘻プロトコルから総実験動物数の減少を含む、元のリンパ瘻プロトコルに比べていくつかの利点があります26,27;全体的な実験時間を2日から1日に短縮する。そして最後に、マウスの回復期間を、突発的な痛みや術後転帰不良が発生する可能性のある一晩(>18時間)から、より管理しやすい~術後6時間に短縮しました。
この1日プロトコルの特徴は、人道的な考慮事項とエンドポイントに焦点を当てていることです。これらは最優先されなければなりません:(1)動物は十二指腸内またはIV置換液を受けなければなりません。(2)それらは暖かく、できるだけ痛みのない状態に保たれなければなりません(実験デザインと抗炎症効果を回避する必要性に応じて、術後のブプレネックスおよび/またはカルプロフェンを使用)。(3)出血、震え、下痢、または苦痛の兆候はすべて、人道的なエンドポイントの説得力のある理由です。厳格なIACUCガイドラインによると、イソフルランとそれに続く頸部脱臼は良好なエンドポイントです。手術の生存率は1日で~70%(元の2日間の手術では~40%)ですが、研究者は苦痛の兆候で実験を終了することを躊躇しないでください。動物の数を計画する際には、これを考慮に入れる必要があります。
この技術のトラブルシューティングに関しては、リンパカニューレの正常な配置がこの外科的処置の主要なボトルネックです。手術の練習中は、手術の約2時間前に0.3mLのオリーブオイルをマウスに強制投与するのに役立ちます。これにより、腸間膜リンパ管へのカイロミクロンの分泌が引き起こされ、「乳白色」でより目立つようになります。メチレンブルーも使用できますが、乳白色のリンパ管ほど目立たないことがよくあります。リンパカニューレの留置および接着剤によるその配置の後に、腸間膜リンパがカニューレを通って収集血管にうまく流れている場合、十二指腸注入チューブの配置に進むことができる。時折、リンパ液は連続的に流れないかもしれませんが、動物が回転テーブルに置かれると再び流れ始めるかもしれません。重要なことに、リンパ管内の血栓に注意してください。これらは、リンパ管への逆流圧力を防ぐためにチューブからマッサージする必要があります。
トリグリセリド分泌およびリンパ流速に加えて、この技術を使用して、以下の脂質吸収動態およびカイロミクロン特性を決定することができる。
カイロミクロン分泌45,48,49
脂肪を含む食事の直後に、循環血漿トリグリセリドの一時的な上昇があります。.トリグリセリドは本質的に疎水性であるため、血液に可溶になるように最初に乳化する必要があります50。小腸腸細胞はこの役割を果たし、食事性トリグリセリドをカイロミクロン乳剤粒子51に包装する。カイロミクロンは、そのコアにコレステロールと食事性トリグリセリドを含み、apoB-48、apoA-I、apoA-IV、およびapoC-III52,53,54,55を含むリン脂質とアポリポタンパク質に囲まれています。ApoB-48は必須の構造タンパク質であり、他のアポリポタンパク質はカイロミクロンの代謝や血液からのクリアランスに必要な様々な機能を持っています。トリグリセリドやアポリポタンパク質の含有量など、カイロミクロンの主要な特性を判断するには、ここに示す1日リンパ瘻法を使用する必要があります。カイロミクロン分泌率は、リンパ液に分泌される注入された3H-トリグリセリドの割合であり、毎時のリンパサンプルをカウントすることによってシンチレーションによって測定されます。これは、詳細なカイロミクロン特性評価48、49、56、57、58と組み合わせることができる。毎時リンパサンプルは、組み合わせることも、別々に保管することもできます。リンパ液を超遠心チューブに移し、0.9%NaClと混合した後、300〜500μLの0.87%NaClを注意深く重ねます。次に、サンプルを110,000 x gで4°Cで16時間超遠心分離します。単離されたカイロミクロンを含むトップフラクションを収集し、トリグリセリドアッセイキットを使用してトリグリセリド濃度をテストします。簡単に説明すると、2 μLのカイロミクロン(1:10希釈)を200 μLの酵素試薬とともに室温で96ウェルプレートで10分間インキュベートします。プレートは500nmのプレートリーダーによって読み取られ、標準物質とブランクはトリグリセリド濃度の計算に使用されます。カイロミクロンサイズは、陰性染色および透過型電子顕微鏡(TEM)14,29によって決定できます。トリグリセリドおよびコレステロールは、化学的アッセイおよびアポリポタンパク質含有量(apoB-48、A-I、C-II、C-III)によってELISAキットまたはウェスタンブロットによって定量することができる。
脂質吸収の一次部位の決定48,59
3H-トリグリセリドまたは放射性標識混合食の注入後6時間で十二指腸、空腸、回腸の管腔および上皮細胞コンパートメントを単離することにより、内容物をフォルチ抽出して、3H-トリグリセリドのどれだけが上皮細胞膜を横切って吸収されるか(正常)、または小腸の長さに沿って内腔に保持されるか(異常)を決定する48.これらの研究は、消化管の運動性に潜在的な違いがある場合60、61、62、胆汁酸(脂質吸収全体で非常に活性が高く、回腸に再吸収される)63、64、65、66、または栄養素が間違った解剖学的位置(回腸または結腸)に吸収されているという懸念がある場合に特に影響を及ぼします67。、68,69,70。
吸収性上皮細胞への3H-トリグリセリド輸送のメカニズムの同定 48
これは、腸管腔で3H-トリグリセリドに加水分解されて3H-遊離脂肪酸に加水分解され、粘膜に吸収され、カイロミクロンとして分泌される前に細胞内の3H-トリグリセリドに再エステル化される割合を計算することによって行われる。これは、食事性トリグリセリドの分解生成物への移動とその後のカイロミクロンへの包装を示すために追跡できるため、吸収/分泌障害の強力なマーカーです。脂肪酸吸収機構(CD36、FABP、ACSL)、再エステル化経路(MGAT、DGAT、MTTP、apoB)、およびアポリポタンパク質(アポC-III、B-48、C-II、A-I、A-IV)のmRNA発現は、RT-PCRによってさらに定量することができます。
この技術の将来の用途は、腸器官クロストーク、代謝、免疫、栄養素吸収、環境食事汚染物質、またはGIシステムに関与するその他の疾患への関心によってのみ制限されます。重要な腸間膜リンパ系へのアクセスが困難なため、多くの説得力のある実験や仮説が行き詰まっている可能性があり、この視覚化されたプロトコルの目標は、この技術をより簡単に利用できるようにすることです。カイロミクロンとそれらが最初に存在する腸間膜リンパを分離することは、全身代謝を理解する上で重要な部分です。1日マウスリンパ瘻モデルは、これらの事象を研究するための強力な生理学的モデルである。
The authors have nothing to disclose.
嚢胞性線維症財団(パイロットおよび実現可能性賞1810、ABK)、ライニン財団(シナジー賞、PI GJ RandolphおよびCo-I ABK)、および国立衛生研究所(R01DK118239、R03DK116011からABK)にこれらの研究を支援してくださったことに非常に感謝しています。
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |