Detta protokoll beskriver ett detaljerat kirurgiskt protokoll för att isolera strömmande tarmlymf som svar på intraduodenala näringsinfusioner hos möss. Detta möjliggör fysiologisk bestämning av total intestinal lipidabsorption och chylomikronsyntes och utsöndring som svar på olika experimentella näringsämnen.
Intestinala lipoproteiner, särskilt triglyceridrika chylomikroner, är en viktig drivkraft för metabolism, inflammation och hjärt-kärlsjukdomar. Att isolera intestinala lipoproteiner är dock mycket svårt in vivo eftersom de först utsöndras från tunntarmen till mesenteriska lymfatiken. Chylomikroninnehållande lymfa töms sedan i den subklaviska venen från bröstkanalen för att leverera komponenter i måltiden till hjärtat, lungorna och slutligen hela kroppscirkulationen. Att isolera naiva chylomikroner är omöjligt från blod eftersom chylomikrontriglycerid genomgår hydrolys omedelbart efter interaktion med lipoproteinlipas och andra lipoproteinreceptorer i omlopp. Därför har den ursprungliga 2-dagars lymffistelproceduren, beskriven av Bollman et al. hos råttor, historiskt använts för att isolera färsk mesenterisk lymf innan den kommer in i bröstvenen. Det protokollet har förbättrats och professionaliserats av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren, vilket möjliggör analys av dessa kritiska lipoproteiner och sekret från tarmen. Tso lymffistelproceduren har nu uppdaterats och presenteras här visuellt för första gången. Detta reviderade förfarande är en endags kirurgisk teknik för att installera ett duodenalt matningsrör, kanylera den mesenteriska lymfkanalen och samla lymf efter en måltid hos medvetna möss. De stora fördelarna med dessa nya tekniker inkluderar förmågan att reproducerbart samla lymf från möss (som utnyttjar kraften i genetiska musmodeller); den reducerade anestesitiden för möss under implantationen av duodenalinfusionsröret och lymfkanylen; förmågan att kontinuerligt prova lymf under utfodring och postprandial period; förmågan att kvantitativt mäta hormoner och cytokiner före utspädning och enzymatisk hydrolys i blod, och förmågan att samla stora mängder lymf för att isolera intestinala lipoproteiner. Denna teknik är ett kraftfullt verktyg för direkt och kvantitativt mätning av näringsupptag i kosten, tarmlipoproteinsyntes och chylomikronsekretion.
Den fysiologiska betydelsen av det mesenteriska lymfsystemet
De mesenteriska lymfatikerna har beskrivits i någon form sedan ~ 300 f.Kr. när Herophilos beskrev leverportalsystemet och alla “absorberande vener i tarmarna”1,2,3,4,5. I mer än 1 700 år efter denna första beskrivning var en definierande egenskap hos tarmlymfatiker närvaron av mjölkaktig vätska i den mesenteriska lymfen strax efter en måltid3. Det är nu känt att mjölkaktig, chylomikroninnehållande lymfa (“chylous” lymfa) inte rinner ut i portvenen och levern utan istället färdas genom cisterna chyli in i bröstkanalen och slutligen förenar blodet vid vänster subklavisk ven6. På grund av detta anatomiska arrangemang färdas chylous lymf först genom hjärtat och lungorna innan den cirkulerar genom resten av kroppen. Detta innebär att hjärtat och lungorna får ett “första pass” vid sekretionerna i mesenteriallymfan7.
En viktig roll för mesenteriska lymfatiker är deras transport av dietlipider från tunntarmen 8,9,10. Anatomiskt, kylomikroner, intestinala immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, icke-chylomikron lipofila föreningar22,23 , och överskott av vätska kommer in i laktealerna som ligger bakom enterocytkällarmembranet och koncentreras sedan genom lymfkapillärerna till de mesenteriska lymfkörtlarna. Det finns sannolikt många okända mesenteriska lymfatiska komponenter, inklusive metaboliter, antigener, miljöföroreningar, näringsämnen och signalmolekyler.
Komponenterna i mesenterisk lymf har inte identifierats systematiskt, till stor del på grund av svårigheten att isolera mesenterisk lymf. Åtkomst till mesenterisk lymf har alltid varit en allvarlig utmaning eftersom lymfkanalerna är färglösa, och förutom efter en fet måltid när de blir chylous och mjölkiga, innehåller mesenteriska lymfatiker färglös lymfvätska 6,8,9,10.
Nuvarande och vanliga metoder för att isolera tarmlymf
Mesenteriallymfan kan inte nås hos människor (utom i sällsynta och extrema fall där allvarligt gastrointestinalt trauma har inträffat)24. In vivo lymfinsamling är kirurgiskt komplex och krävande. Den ursprungliga 2 dagars lymffistelproceduren beskrevs av Bollman et al.25 och har förbättrats och professionaliserats av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren 26,27. Lymffistelproceduren gör det möjligt för utredare att samla flytande lymf från medvetna djur under en 6 h duodenal lipidinfusionsperiod.
Lymffistelmodellen har huvudsakligen använts hos råttor för att mäta lymfflödeshastighet, produktionen av triglycerid och kolesterol (eller andra duodenal-infunderade föreningar), chylomikronsammansättning och tarmhormonkoncentrationer. I mindre utsträckning kan denna teknik också användas på möss, även om kirurgisk överlevnad och lymfvolym lider. På grund av svårigheterna att se mesenteriska lymfkanaler har historiska metoder inkluderat kanylering av mesenterisk lymf hos större djur som minigrisar28, får29, grisar30, hundar31 och råttor17. Att arbeta med dessa större modeller är resurskrävande och tillåter inte studier i knock-in- eller knock-out-modeller.
Alternativa tillvägagångssätt har också använts. Chylomikroner kan isoleras från blod i postprandialt tillstånd (även om dessa delvis hydrolyseras av plasmalipoproteinlipas)32,33,34,35. Bröstkanalen kan också kanyleras, även om lymfan som samlas där innehåller en blandning av mesenterisk lymf och extra-intestinal lymfdränage26,36. In vitro utsöndrar Caco-2-celler en chylomikronliknande partikel som svar på fettsyrabehandling, och dessa celler kan samodlas med relevanta lymfatiska endotel- eller kärlceller37,38. Humana och musintestinala organoidkulturer har visat sig bearbeta apikala lipider och utsöndrar chylomikroner 39,40,41,42. Dessa modeller är mycket fördelaktiga och möjliggör mekanistiska insikter i tunntarmsfysiologi, men de kan inte replikera komplexiteten, fysiokemiska gradienter eller dynamiskt lymfflöde av in situ mesenteriska lymfatiker.
Fördelar med 1-dagars muslymffistelmodellen som presenteras här
Med avseende på dessa andra metoder för att isolera intestinala lipoproteiner har Tso Lab-lymffisteltekniken traditionellt ansetts vara guldstandardtekniken för att mäta absorptionen av kostnäringsämnen i mesenterisk lymfa. Denna in vivo-teknik har fördelen att fånga viktiga fysiologiska aspekter av lipidabsorption i kosten – det dynamiska utseendet av föreningar under absorptionsperioden, vilket kräver upprepad provtagning av flytande mesenterisk lymf hos levande djur med duodenala näringsämnen. Denna kirurgiska teknik mäter också tarmhormoner och cytokiner direkt i deras fysiologiska fack snarare än i blod, där de späds ut och enzymatiskt bryts ned17,43.
Om den experimentella frågan kräver en förståelse för lipidsekretionsdynamik eller den dynamiska absorptionen och metabolismen av någon hydrofob GI-förening eller läkemedel, är denna teknik inte bara lämplig utan är också det enda tillvägagångssättet som interpolerar rörelsen av luminalt innehåll från proximal till distal tarm (mage till kolon) och från apikal till basolateral yta (luminalt innehåll genom enterocyt till lakteals och portalcirkulation). Eftersom denna teknik använder luminal leverans av näringsämnen genom den intraduodenala katetern, och eftersom den flytande mesenteriska lymfen avleds och samlas in, är hela absorptionsapparaten under experimentell kontroll och kan användas för att kvalitativt bedöma små tarmabsorptionsprofiler.
Presenteras visuellt här för första gången är en stor uppdatering av Tso Lab-lymffistelmodellen, som (1) minskar experimenttiden till en 1 dags kirurgisk implantation och experimentell insamlingsperiod; (2) förbättrar musens överlevnad och djurskydd, och (3) ökar reproducerbarheten av tillvägagångssättet hos möss för att utnyttja kraften i musgenetiska modeller. Denna teknik måste betraktas som en guldstandard för alla experimentella frågor om tarmsekret, lipoproteiner eller dietlipidabsorption och är den bästa tekniken för högkvalitativ bestämning av lipidabsorptionskinetik och kylomikroner.
Den ursprungliga 2-dagars lymffistelproceduren beskrevs av Bollman et al.25 och praktiserades av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren 26,27. Protokollet som presenteras här är ett kraftfullt tillägg till denna klassiska, guldstandardmetod för att identifiera, kvantifiera och förstå de unika chylous sekretionerna i tunntarmen, liksom in vivo-dynamiken i kostnäringsabsorption och metabolism, tarmhormoner och tarmimmunitet.
Fördelarna med denna modell inkluderar (1) förmågan att kontinuerligt prova mesenterisk lymfa under hela utfodrings- och postprandialperioden snarare än statisk provtagning vid en tidpunkt under antingen absorption, matsmältning eller utsöndring; 2. mätning av tarmhormoner och cytokiner direkt i deras fysiologiska avdelning snarare än i blod, där de späds ut och enzymatiskt bryts ned17,44; (3) förmågan att isolera, kvantifiera och karakterisera lipoproteinerna som utsöndras av tunntarmen efter intag av en lipidmåltid och frånvaron av endotellipaser i mesenteriallymfan, vilket bevarar chylomikrontriglyceridkoncentrationer och inhemsk chylomikronstruktur46,47; (4) förmågan att direkt mäta lymfflödeshastighet, produktionen av triglycerid och kolesterol (eller andra duodenal-infunderade föreningar), chylomikronsammansättning och tarmhormonkoncentrationer. Slutligen tillåter detta protokoll att samla relativt stora mängder >50 μL lymf varje timme under en 6-timmarsperiod. Eftersom vätskan fylls på med intraduodenal saltlösning och glukosinfusion, förbättras lymffistelmodellen signifikant jämfört med andra lymfprovtagningstekniker och resulterar i flödande snarare än statiska pooler av mesenterisk lymfa. Eftersom volymen är ett stort hinder för lipidomiska, proteomiska och metabolomiska metoder är detta en stor styrka.
1-dagars muslymffistelprotokollet som beskrivs här har flera fördelar jämfört med det ursprungliga lymffistelprotokollet, inklusive en minskning av det totala antalet försöksdjur från tidigare beskrivna 2-dagars lymffistelprotokoll26,27 på grund av en högre överlevnad efter operationen; en minskning av den totala försökstiden från 2 dagar till en enda dag; och slutligen en minskning av återhämtningsperioden för möss från över natten (>18 timmar), där genombrottssmärta eller dåliga postoperativa resultat kan uppstå, till en mer hanterbar ~ 6 h efter operationen.
En funktion i detta 1-dagarsprotokoll är fokus på humana överväganden och slutpunkter. Dessa måste ha högsta prioritet: (1) djur måste få intraduodenala eller intravenösa ersättningsvätskor; (2) De måste hållas varma och så smärtfria som möjligt (med postoperativt Buprenex och/eller karprofen, beroende på försökets utformning och behovet av att undvika antiinflammatoriska effekter). (3) blödning, skakningar, diarré eller tecken på ångest är alla tvingande skäl för en human endpoint. Enligt strikta IACUC-riktlinjer är isofluran följt av cervikal dislokation ett bra effektmått. Kirurgisk överlevnad är ~ 70% för en enda dag (jämfört med ~ 40% för den ursprungliga 2-dagars operationen), men utredare bör inte tveka att avsluta experimentet vid ett tecken på nöd. Detta bör beaktas vid planering av antalet djur.
När det gäller felsökning av denna teknik är framgångsrik placering av lymfkanylen den största flaskhalsen i detta kirurgiska ingrepp. Medan du övar operationen hjälper det att sonda musen med 0,3 ml olivolja cirka 2 timmar före operationen. Detta kommer att orsaka utsöndring av chylomikroner i den mesenteriska lymfkanalen, vilket gör att den verkar “mjölkaktig” och mer synlig. Methylenblått kan också användas men är ofta mindre uppenbart än den mjölkiga lymfkanalen. Om den mesenteriska lymfen efter placeringen av lymfkanylen och dess placering med lim framgångsrikt strömmar genom kanylen in i ett uppsamlingskärl, kan man fortsätta med placeringen av ett duodenalt infusionsrör. Ibland kan lymfan inte flöda kontinuerligt men kan börja flöda igen när djuret placeras på det roterande bordet. Kritiskt, se upp för blodproppar i lymfröret. Dessa bör masseras ut ur rören för att förhindra återflödestryck på lymfkanalen.
Förutom triglyceridsekretion och lymfflödeshastighet kan denna teknik användas för att bestämma följande lipidabsorptionskinetik och chylomikronegenskaper:
Utsöndring av kylomikron45,48,49
Omedelbart efter en måltid som innehåller fett sker en övergående ökning av cirkulerande plasmatriglycerid. Eftersom triglycerider i sig är hydrofoba måste de först emulgeras för att vara lösliga i blod50. Tunntarmsenterocyter utför denna roll och paketerar diettriglycerid i chylomikronemulsionspartiklar51. Chylomikroner innehåller kolesterol och diettriglycerid i sin kärna, omgiven av fosfolipider och apolipoproteiner, inklusive apoB-48, apoA-I, apoA-IV och apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 är det väsentliga strukturella proteinet, och de andra apolipoproteinerna har olika funktioner som krävs för chylomikronmetabolism och clearance från blodet. För att bestämma de viktigaste egenskaperna hos chylomikroner, inklusive deras triglycerid- och apolipoproteininnehåll, bör 1-dagars lymffistelteknik som visas här användas. Chylomikronsekretionshastigheten är procentandelen infunderad 3H-triglycerid som utsöndras i lymfan och mäts genom scintillation genom att räkna lymfprover per timme. Detta kan kombineras med detaljerad chylomikronkarakterisering 48,49,56,57,58. Lymfprover per timme kan kombineras eller förvaras separat. Lymf överförs till ultracentrifugrör, blandas med 0,9% NaCl och överlagras sedan försiktigt med 300-500 μL 0,87% NaCl. Proverna ultracentrifugeras sedan vid 110 000 x g vid 4 °C i 16 timmar. De översta fraktionerna som innehåller isolerade chylomikroner samlas in och testas för triglyceridkoncentrationer med hjälp av triglyceridanalyssatsen. Kortfattat inkuberas 2 μL av chylomikron (1:10 spädning) med 200 μL enzymreagens vid rumstemperatur i 10 minuter i en 96-brunnsplatta. Plattan läses av en plattläsare vid 500 nm, och standarderna och ämnena används för beräkning av triglyceridkoncentrationer. Chylomikronstorleken kan sedan bestämmas genom negativ färgning och transmissionselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglycerid och kolesterol kan kvantifieras genom kemisk analys och apolipoproteininnehåll (apoB-48, A-I, C-II, C-III) med ELISA-kit eller Western blot.
Bestämning av den primära platsen för lipidabsorption 48,59
Genom att isolera de luminala och epiteliala cellfacken i tolvfingertarmen, jejunum och ileum vid 6 timmar efter infusionen av 3H-triglycerid eller en radioaktivt märkt blandad måltid extraheras innehållet Folch för att bestämma hur mycket av 3H-triglyceriden som absorberas över epitelcellmembranet (normalt) eller behålls i lumen (onormalt) längs tunntarmen48 . Dessa studier är särskilt effektiva om det finns potentiella skillnader i GI-motilitet 60,61,62, om det finns en hypotes om gallsyror (mycket aktiva under lipidabsorption och själva reabsorberas i ileum)63,64,65,66, eller om det finns en oro för att näringsämnen absorberas på fel anatomisk plats (ileum eller till och med kolon)67 ,68,69,70.
Identifiera mekanismer för 3H-triglyceridhandel i absorberande epitelceller48
Detta utförs genom att beräkna procentandelen av3 H-triglycerid hydrolyserad till 3 H-fri fettsyra i tarmlumen, absorberad i slemhinnan och omförestrad till intracellulär 3H-triglycerid före utsöndring som chylomikroner. Detta är en kraftfull markör för absorptions- / utsöndringsdefekter eftersom det kan spåras för att visa rörelsen av diettriglycerid i dess nedbrytningsprodukter och efterföljande förpackning i chylomikroner. mRNA-uttryck av fettsyraabsorptionsmaskineriet (CD36, FAFP, ACSL), reförestringsväg (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) och apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan kvantifieras ytterligare med RT-PCR.
Framtida tillämpningar av denna teknik begränsas endast av intresse för överhörning mellan tarmorgan, metabolism, immunitet, näringsabsorption, miljöföroreningar eller någon annan sjukdom med en roll i GI-systemet. Det är troligt att många övertygande experiment och hypoteser har stoppats på grund av svårigheten att komma åt det kritiska mesenteriska lymfsystemet, och målet med detta visualiserade protokoll är att göra denna teknik mer lättillgänglig. Att isolera chylomikroner och den mesenteriska lymfan där de ursprungligen bor är en kritisk del av förståelsen av hela kroppens metabolism; 1 Day Mouse Lymph Fistel-modellen är en kraftfull fysiologisk modell för att studera dessa händelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi är oerhört tacksamma till Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, till ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, till PI GJ Randolph och Co-I ABK) och National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 till ABK) för deras stöd till dessa studier.
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |