Количественная оценка и анализ В-клеток миокарда на основе проточной цитометрии

Summary

Здесь мы сообщаем протокол количественной оценки и дифференцировки В-лимфоцитов миокарда на основе их расположения во внутрисосудистом или эндотелиальном пространстве с помощью проточной цитометрии.

Abstract

Растущее количество доказательств показывает, что В-лимфоциты играют важную роль в контексте физиологии миокарда и адаптации миокарда к травмам. Однако в литературе приводятся контрастные данные о распространенности В-клеток миокарда. Сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов или присутствуют, но с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки, или довольно редки. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокарда, но одна группа не сообщила об изменениях в количестве В-клеток поврежденного миокарда. Реализация общего, воспроизводимого метода оценки распространенности В-клеток миокарда имеет решающее значение для гармонизации наблюдений различных исследовательских групп и, таким образом, способствует продвижению изучения взаимодействий миокарда В-клеток. Основываясь на нашем опыте, кажущиеся контрастными наблюдения, о которых сообщается в литературе, вероятно, связаны с тем фактом, что мышиные В-клетки миокарда в основном внутрисосудистые и связаны с микрососудистым эндотелием. Поэтому количество В-клеток, извлеченных из мышиного сердца, чрезвычайно чувствительно к условиям перфузии, используемым для очистки органа, и к используемому методу пищеварения. Здесь мы сообщаем об оптимизированном протоколе, который учитывает эти две критические переменные определенным образом. Этот протокол обеспечивает воспроизводимый, основанный на проточной цитометрии анализ количества мышиных В-клеток миокарда и позволяет исследователям различать внесосудистые и внутрисосудистые В-клетки миокарда.

Introduction

В-лимфоциты являются узкоспециализированными иммунными клетками, которые играют важную роль как в адаптивных, так и во врожденных иммунных реакциях¹. Существует две основные популяции В-клеток: меньшая популяция клеток В1, которые в основном вырабатываются во время эмбриональной жизни, и преобладающая популяция клеток В2, которые производятся во взрослой жизни в костном мозге¹. После созревания в костном мозге В-клетки мигрируют в первичные и вторичные лимфоидные органы. Оттуда они непрерывно рециркулируют между лимфоидными органами, проходящими через кровеносные сосуды, и лимфатическими сосудами². В-клетки экспрессируют специфические антитела на своей поверхности, которые функционируют как рецепторы. Когда В-клетки сталкиваются с антигеном, который связывается с их рецептором, может быть запущен активирующий сигнал. Активированные В-клетки либо мигрируют в ткань, где был обнаружен антиген, либо возвращаются в костный мозг, где они могут созревать в плазматические клетки^, продуцирующие антитела ^3,4.

В последнее время было признано, что сердце содержит значительную популяцию В-клеток. Исследования на грызунах показали, что В-клетки колонизируют сердце на ранних стадиях эмбрионального развития⁵, и что В-клетки, ассоциированные с миокардом, в основном являются внутрисосудистыми, наивными B2-клетками, прилипшими к эндотелию ^6,7, с небольшим процентом клеток B1⁷. Есть еще много областей неопределенности, но имеющиеся данные указывают на то, что В-клетки играют важную роль как в наивном сердце, так и в контексте адаптации миокарда к травме.

Исследования на наивного мышиного сердца показали, что на исходном уровне В-клетки миокарда в основном располагаются во внутрисосудистом пространстве, прилипают к эндотелию (>95% мышиных сердечных В-клеток оказались расположенными во внутрисосудистом пространстве). Было обнаружено, что эти В-клетки имеют паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов циркулирующих В-клеток, выделенных из периферической крови. Анализ наивных сердец у животных с дефицитом В-клеток и сингенного контроля показал, что животные, лишенные В-клеток, имели меньшие сердца и более высокую фракцию^{выброса 6}. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клетки могут модулировать рост миокарда и / или функцию миокарда, и что не только интерстициальные, но и внутрисосудистые В-клетки могут быть ответственны за такие наблюдения. Было также обнаружено, что В-клетки модулируют фенотип резидентных макрофагов миокарда⁸.

Несколько исследований показали, что В-клетки играют важную роль в контексте адаптации миокарда к травме 8,9,10,11,12,13. В-клетки временно накапливаются в поврежденном сердце, вероятно, через CXCL13-CXCR5 зависимый механизм ^11,13. Оттуда В-клетки способствуют неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов, которые включают цитокин-опосредованный моноцит, рекрутирующий ^9,12. Кроме того, В-клетки могут вырабатывать антитела против сердечных белков, которые могут способствовать расширению сердечных повреждений и неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . В-клетки также могут оказывать защитное воздействие на поврежденное сердце через секрецию IL-10¹⁰.

По мере роста числа групп, изучающих роль В-клеток в наивном и поврежденном сердце, становится все более и более важным определить общие протоколы для правильной количественной оценки и оценки В-клеток миокарда и, таким образом, избежать несоответствий, которые уже начали появляться в литературе. До сих пор сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов⁷ и присутствуют с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки^26,27 или довольно редко²⁸. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокарда^{на 7,9,13}, но одна группа сообщила об отсутствии изменений в количестве В-клеток поврежденного миокарда²⁹. Исследования сердечных иммунных клеток редко дают подробную информацию об условиях перфузии, и нет единого мнения об условиях пищеварения. Поскольку в сердце грызунов большая часть В-клеток является внутрисосудистой, а извлечение иммунных клеток из миокарда сильно зависит от используемого метода пищеварения, различия, о которых сообщается в литературе, могут быть результатом различий в перфузии органов и переваривании тканей.

Здесь представлен подробный метод количественной оценки В-клеток мышиного миокарда на основе проточной цитометрии, который максимизирует выход восстановления В-клеток за счет оптимизации условий перфузии и пищеварения и позволяет различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда⁶. Этот протокол является адаптацией и оптимизацией других подобных протоколов, которые различают внутрисосудистые и интерстициальные иммунные клетки 28,30,31.

В этом протоколе мы стандартизируем перфузию миокарда для устранения В-клеток, плавающих во внутрисосудистом пространстве, без удаления биологически значимых В-клеток, прилипших к микрососудистому эндотелию. Более того, основываясь на предыдущих протоколах, которые описывали использование внутривенного введения антител для различения внутрисосудистых и интерстициальных иммунных клеток³², и используя тот факт, что В-клетки экспрессируют поверхностный маркер B220³³, мы демонстрируем, как различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда посредством внутрисосудистой инъекции B220-специфического антитела непосредственно перед жертвоприношением животных и сердечной перфузией. Этот протокол актуален для исследований любого ученого, заинтересованного во включении анализа В-клеток миокарда в наивное и травмированное сердце. Широкое внедрение этого протокола уменьшит несоответствия между исследовательскими группами, позволит анализировать изменения во внутрисосудистых и внесосудистых пулах В-клеток миокарда и, таким образом, будет способствовать продвижению открытий в области иммунологии сердца.

Таким образом, протокол представляет собой оптимизированный рабочий процесс для количественной оценки и анализа В-клеток миокарда с помощью проточной цитометрии и в то же время различения клеток, расположенных во внесосудистом пространстве и внутрисосудистом пространстве.

Protocol

Все эксперименты, описанные в этой рукописи, были выполнены с одобрения IACUC в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса. 1. Препараты Подготовьте буфер FACS, как описано в таблице 1. Убедитесь, что есть достаточно CO2 для усыпления животн…

Representative Results

После завершения сбора и сбора всех событий данные должны быть проанализированы в соответствии со стандартной практикой проточной цитометрии. Фокус анализа будет варьироваться в зависимости от индивидуальной цели каждого эксперимента. В этом случае проводилась количественная оценк…

Discussion

Растущее количество доказательств указывает на то, что В-клетки играют важную роль в контексте физиологии миокарда и ремоделирования миокарда / адаптации к травме 7,8,9,10,11,12,13,36.^…

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I – 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend