Protokollen præsenterer to metoder til bestemmelse af kinetikken af de fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 og Broccoli. Den første metode beskriver, hvordan man måler fluorogen aptamerkinetik in vitro med en pladelæser, mens den anden metode beskriver målingen af fluorogen aptamerkinetik i celler ved flowcytometri.
Fluorogene RNA-aptamerer er blevet anvendt i levende celler til at mærke og visualisere RNA’er, rapportere om genekspression og aktivere fluorescerende biosensorer, der detekterer niveauer af metabolitter og signalmolekyler. For at studere dynamiske ændringer i hvert af disse systemer er det ønskeligt at opnå realtidsmålinger, men målingernes nøjagtighed afhænger af, at kinetikken af den fluorogene reaktion er hurtigere end prøveudtagningsfrekvensen. Her beskriver vi metoder til at bestemme in vitro– og cellulær tændskinetik for fluorogene RNA-aptamerer ved hjælp af en pladelæser udstyret med henholdsvis en prøveinjektor og et flowcytometer. Vi viser, at in vitro-kinetikken for fluorescensaktiveringen af spinat2- og broccoli-aptamererne kan modelleres som tofasede associeringsreaktioner og har forskellige hurtige fasehastighedskonstanter på henholdsvis 0,56 s-1 og 0,35 s-1. Derudover viser vi, at den cellulære kinetik for fluorescensaktiveringen af spinat2 i Escherichia coli, som yderligere er begrænset af farvestofdiffusion i de gramnegative bakterier, stadig er tilstrækkelig hurtig til at muliggøre nøjagtig prøveudtagningsfrekvens på minutskalaen. Disse metoder til analyse af fluorescensaktiveringskinetik kan anvendes på andre fluorogene RNA-aptamerer, der er udviklet.
Fluorogene reaktioner er kemiske reaktioner, der genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer udfører typisk denne funktion ved at binde et lille molekylefarvestof for at forbedre dets fluorescenskvanteudbytte (figur 1A)1. Forskellige fluorogene RNA-aptamersystemer er udviklet og består af specifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende farvestofligander1. Fluorogene RNA-aptamerer er blevet tilføjet til RNA-transkripter som fluorescerende tags, der muliggør levende cellebilleddannelse af mRNA’er og ikke-kodende RNA’er 2,3,4. De er også blevet placeret efter promotorsekvenser som fluorescerende reportere af genekspression, svarende til brugen af grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortset fra at rapporteringsfunktionen er på RNA-niveau 5,6. Endelig er fluorogene RNA-aptamerer blevet inkorporeret i RNA-baserede fluorescerende biosensorer, som er designet til at udløse den fluorogene reaktion på et specifikt lille molekyle. RNA-baserede fluorescerende biosensorer er udviklet til levende cellebilleddannelse af forskellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.
Der er stigende interesse for udviklingen af fluorogene RNA-aptamerer til at visualisere dynamiske ændringer i RNA-lokalisering, genekspression og små molekylesignaler. For hver af disse anvendelser er det ønskeligt at opnå realtidsmålinger, men målingernes nøjagtighed afhænger af, at kinetikken af den fluorogene reaktion er hurtigere end prøveudtagningsfrekvensen. Her beskriver vi metoder til at bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Broccoli13 ved hjælp af en pladelæser udstyret med en prøveinjektor og til at bestemme den cellulære tændingskinetik forspinat2 udtrykt i Escherichia coli ved hjælp af et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerer blev valgt, fordi de er blevet anvendt til at studere RNA-lokalisering 2,3,4, de er blevet brugt i journalister 5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11, og de tilsvarende farvestofligander (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommercielt tilgængelige. Et resumé af deres in vitro-egenskaber bestemt i litteraturen findes i tabel 1 4,13,14, som dannede grundlag for protokoludviklingen (f.eks. de anvendte bølgelængder og farvestofkoncentrationer). Disse resultater viser, at de fluorogene reaktioner, der påvirkes af RNA-aptamerer, er hurtige og ikke bør hindre nøjagtige målinger for de ønskede cellebiologiske anvendelser.
For in vitro-kinetikeksperimentet kan den samme generelle protokol modificeres til at måle in vitro-kinetikken af en RNA-baseret fluorescerende biosensor, der indeholder både et ligandbindende og fluorophorebindende domæne8. I dette tilfælde skal RNA’et inkuberes med fluoroforen inden målinger ved injektion af liganden for at opnå ligandresponskinetik. Hvis der observeres høj variabilitet mellem replikaterne, kan man fejlfinde ved at kontrollere, at hver prøve får lov t…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud til MCH: NSF-BSF 1815508 og NIH R01 GM124589. MRM blev delvist støttet af uddannelsestilskud NIH T32 GM122740.
Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |