Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Summary

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten.

Abstract

Hartfalen blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, waardoor er een dringende behoefte is aan betere preklinische modellen van het menselijk hart. Tissue engineering is cruciaal voor fundamenteel wetenschappelijk hartonderzoek; in vitro menselijke celkweek elimineert de verschillen tussen soorten van diermodellen, terwijl een meer weefselachtige 3D-omgeving (bijv. met extracellulaire matrix en heterocellulaire koppeling) in vivo omstandigheden in grotere mate simuleert dan traditionele tweedimensionale cultuur op plastic petrischalen. Elk modelsysteem vereist echter gespecialiseerde apparatuur, bijvoorbeeld op maat ontworpen bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur. Bovendien zijn deze protocollen vaak ingewikkeld, arbeidsintensief en worden ze geplaagd door het falen van de kleine, delicate weefsels.

Dit artikel beschrijft een proces voor het genereren van een robuust humaan gemanipuleerd hartweefsel (hECT) modelsysteem met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten voor de longitudinale meting van de weefselfunctie. Zes hECT’s met lineaire stripgeometrie worden parallel gekweekt, waarbij elke hECT wordt opgehangen aan een paar krachtgevoelige polydimethylsiloxaan (PDMS)-palen die aan PDMS-rekken zijn bevestigd. Elke post is afgedekt met een zwarte PDMS stable post tracker (SPoT), een nieuwe functie die het gebruiksgemak, de doorvoer, het vasthouden van weefsel en de gegevenskwaliteit verbetert. De vorm maakt het mogelijk om post-afbuigingen betrouwbaar optisch te volgen, wat resulteert in verbeterde twitch force tracings met absolute actieve en passieve spanning. De dopgeometrie elimineert weefselfalen als gevolg van hECT’s die van de palen glijden, en aangezien ze een tweede stap na de fabricage van PDMS-rekken inhouden, kunnen de SPoT’s worden toegevoegd aan bestaande PDMS-postgebaseerde ontwerpen zonder grote wijzigingen in het fabricageproces van de bioreactor.

Het systeem wordt gebruikt om het belang aan te tonen van het meten van de hECT-functie bij fysiologische temperaturen en toont een stabiele weefselfunctie tijdens data-acquisitie. Samenvattend beschrijven we een state-of-the-art modelsysteem dat belangrijke fysiologische omstandigheden reproduceert om de biotrouw, efficiëntie en nauwkeurigheid van gemanipuleerde hartweefsels voor in-vitrotoepassingen te bevorderen.

Introduction

Gemanipuleerde hartweefselmodellen zijn er in een breed scala aan geometrieën en configuraties voor het recapituleren van verschillende aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche die moeilijk te bereiken zijn met traditionele tweedimensionale celkweek. Een van de meest voorkomende configuraties is de lineaire weefselstrip^, met flexibele ankers aan elk uiteinde om zelfassemblage van weefsel te induceren en het weefsel te voorzien van een gedefinieerde voorspanning en een uitlezing van de resulterende spiertrekkingen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. De opgewekte kracht kan robuust worden bepaald door het optisch volgen van de weefselverkorting en het gebruik van de elastische bundeltheorie om de kracht te berekenen uit de gemeten doorbuigingen en de veerconstante van de ankers 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Hartweefselengineering is echter nog steeds een evoluerend vakgebied en er blijven enkele uitdagingen bestaan. Gespecialiseerde apparatuur, zoals op maat gemaakte bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur, is vereist voor elk modelsysteem 10,29,30,31. De omvang en complexiteit van de micro-omgeving van deze constructen worden vaak beperkt door een lage doorvoer als gevolg van arbeidsintensieve protocollen, grote aantallen cellen en weefselkwetsbaarheid. Om dit aan te pakken, hebben sommige groepen zich gewend tot de fabricage van microweefsels die slechts honderden of duizenden cellen bevatten om high-throughput-assays mogelijk te maken die nuttig zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Deze kleinere schaal bemoeilijkt echter de nauwkeurige beoordeling van functie¹², elimineert belangrijke aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche (zoals nutriënten/zuurstofdiffusiegradiënten en complexe architectuur³⁶) en beperkt de hoeveelheid materiaal die beschikbaar is voor latere moleculaire en structurele analyse (waarbij vaak pooling van de weefsels nodig is). Tabel 1 geeft een overzicht van enkele configuraties van lineaire weefselstripmodellen in de literatuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Groep		Cellen per weefsel	Weefsels per plaat	Formaat van de plaat		Verankeringsfunctie		Methode voor het verzamelen van functionele gegevens		Gedeelde media bad?	Functionele maat- ter plaatse?
Yoshida (ECT)38		4 miljoen	6	Gemodificeerde plaat met 6 putjes*		kracht omvormer		Directe krachtmeting		Nee	Nee
Chan (hESC-CM-ECT’s)26		310 km-loop	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-berichten		Directe krachtmeting		ja	Nee
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 miljoen	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-draad		Vorm van het weefsel		Nee	ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 km-loop	8			polymeer draad		Vorm van de draad		ja	ja
Costa (enkele hECT)1, 2		1-2 miljoen	4**	Petrischaaltje van 10 cm**		PDMS-berichten		Optische afbuiging (rand-/objecttracking)		ja	ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 k-1 miljoen	6	6 cm Petrischaal		PDMS-berichten		Optische afbuiging (rand-/objecttracking)		ja	ja
Costa (multi-hECT met SPoT)		1 miljoen	6	6 cm Petrischaal		PDMS-palen met zwarte doppen		Optische afbuiging (object volgen)		ja	ja
Passier (EHT)17		245 km-loop	36	Plaat met 12 putjes		PDMS-palen met zwarte doppen		Optische afbuiging (object volgen)		ja	ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 miljoen	12	6 cm Petrischaal		PDMS-palen met doppen		Optische doorbuiging (randdetectie)		ja	ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 km-loop	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-palen met doppen		optische afbuiging (volgen van objecten); Calcium beeldvorming		Nee	ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 miljoen	12	Plaat met 12 putjes		PDMS-palen met doppen		optische afbuiging (randdetectie van na-afbuiging); Calcium beeldvorming		Nee	ja
Zandstra (CaMiRi)22		25 tot 150 km-loop	96	Plaat met 96 putjes		PDMS-palen met haken		Optische doorbuiging (randdetectie)		Nee	ja
Murry23, 24		900 km	24	Plaat met 24 putjes		PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet		Magnetische sensor		Nee	ja
Reich (μTUG)11, 12, 25		Ongedefinieerde	156	Schotel met 156 putjes		PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet		optische tracking (fluorescerende kraal)		ja	ja

Tabel 1: Kenmerken van enkele lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur. Lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen variëren in grootte, doorvoer, ontwerpen van verankeringskenmerken en het faciliteren van gedeelde mediumbaden, evenals de vereisten voor een afzonderlijk spierbadsysteem voor functionele karakterisering. * De onderzoekers gebruikten een in de handel verkrijgbaar gemanipuleerd weefselsysteem op basis van de afmetingen van een standaard plaat met 6 putjes. ** Een modulair systeem waarbij bioreactoren met één weefsel worden verankerd aan elk plastic kweekschaaltje in het gewenste aantal en op de gewenste locatie.

Dit artikel beschrijft het nieuwste protocol voor het vervaardigen van ons gevestigde model van lineair menselijk gemanipuleerd hartweefsel (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 en methoden voor het beoordelen van de contractiele functie van hECT. Elke multi-weefsel bioreactor biedt plaats aan maximaal zes hECT’s in een gedeeld mediumbad en bestaat uit twee “rek”-stukken gemaakt van het siliconenelastomeer polydimethylsiloxaan (PDMS) gemonteerd op een stijf polysulfonframe. Elk PDMS-rek bevat zes flexibele geïntegreerde krachtdetectiepalen met een diameter van 0,5 mm en een lengte van 3,25 mm, en samen bieden twee rekken zes paar palen, die elk één hECT bevatten. Inversie van de bioreactor helpt bij het overwinnen van elke belemmering voor de visualisatie van de hECT’s van onderaf als gevolg van watercondensatie van het kweekmedium of vervormingen van de meniscus van de lucht-vloeistofinterface. Elke samentrekking van een hECT veroorzaakt afbuiging van de geïntegreerde eindposten, en de optische meting van het afbuigsignaal wordt verwerkt tot een kracht-versus-tijdtracering die de contractiele functie van de hECT weergeeft 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Vergeleken met de bioreactoren met één weefsel die doorgaans worden gebruikt voor weefsels van deze grootte, verbetert het ontwerp met meerdere weefsels de experimentele doorvoer en maakt het de studie mogelijk van paracriene signalering tussen aangrenzende weefsels met een potentieel verschillende cellulaire samenstelling. Dit systeem is gevalideerd in gepubliceerde studies die toepassingen beschrijven in ziektemodellering ^4,8, paracriene signalering ^6,7, heterocellulaire cultuur ^5,9 en therapeutische screening ^7,9.

In dit systeem zijn de hECT’s ontworpen om ongeveer 6 mm lang en 0,5 mm in diameter te zijn om een robuuste optische tracking van krachtmetingen met weinig ruis mogelijk te maken. Bovendien worden aspecten van weefselcomplexiteit, zoals diffusiegradiënten en cellulaire organisatie, in evenwicht gehouden met een beheersbare behoefte van 1 miljoen cellen per weefsel. Met standaard CCD-cameratechnologie genereren krachten zo zwak als 1 μN (minder dan 5 μm na afbuiging) een duidelijk signaal, zodat zelfs extreem zwakke contractiele functie, zoals waargenomen bij sommige hECT-ziektemodellen, nauwkeurig kan worden gemeten. Dit vergemakkelijkt ook de gedetailleerde analyse van de twitch-krachtcurve, waardoor de analyse met een hoog gehalte van maximaal 16 contractiliteitsmetrieken⁴¹ mogelijk wordt, waaronder ontwikkelde kracht, contractiesnelheden (+dF/dt) en ontspanning (−dF/dt), en variabiliteit van de beatsnelheid.

Dit protocol begint met instructies voor het vervaardigen van de bioreactorcomponenten. Speciale aandacht wordt besteed aan de stappen om de hECT-opbrengst te maximaliseren, de technische variabiliteit in de weefselfunctie te verminderen en de kwaliteit en diepte van de weefselbeoordeling te optimaliseren. De meeste onderzoeken naar cardiale weefselmanipulatie rapporteren geen percentages van weefselverlies tijdens fabricage en langetermijntesten, hoewel het een bekende uitdaging is in het veld en de doorvoer en efficiëntie van de onderzoeken vermindert²⁷. De hier beschreven methoden voor weefselmanipulatie zijn in de loop der jaren verfijnd om ervoor te zorgen dat alle hECT’s in de meeste bioreactoren behouden blijven (ongeacht hoe de PDMS-rekken zijn vervaardigd). Maar zelfs een verlies van weefsels van 5%-20% kan de statistische power aanzienlijk beïnvloeden, vooral in kleinere experimenten die worden beperkt door het aantal beschikbare cardiomyocyten (bijv. als gevolg van differentiatie-uitdagingen met sommige zieke cellijnen⁴ of vanwege de hoge kosten van commercieel gekochte cardiomyocyten), of door de behandelingstoestand (bijv. beperkte beschikbaarheid of hoge kosten van verschillende behandelingsverbindingen).

Dit protocol beschrijft de fabricage van stabiele posttrackers (SPoT’s), een nieuwe functie van de PDMS-rekken, die fungeren als doppen aan de uiteinden van de krachtgevoelige palen die de hECTs²⁷ bevatten. Er wordt gedemonstreerd hoe de dopgeometrie het hECT-verlies door vallen of aftrekken van de palen aanzienlijk vermindert, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan voor het kweken van hECT’s met een grotere verscheidenheid aan stijfheden en spanningen, die moeilijk te kweken zijn op niet-afgedekte palen. Bovendien bieden de SPoT’s een object met een hoog contrast om de optische tracking van de hECT-contractie te verbeteren door middel van een consistente en goed gedefinieerde vorm²⁷. Dit wordt gevolgd door een beschrijving van het kweken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) en differentiatie van cardiomyocyten op basis van eerder gepubliceerde protocollen ^3,42,43 en een uitleg van hECT-fabricage, kweek en functionele metingen.

Dit artikel gaat ook in op de noodzaak om de weefselfunctie bij fysiologische temperatuur te meten. Menselijk myocardium (zowel foetaal als volwassen gezond en ziek weefsel), evenals hartweefsel van een breed scala aan diersoorten (waaronder ratten, katten, muizen, fretten en konijnen)^44,45, vertoont een duidelijke toename van de frequentie-afgestemde spiertrekkingskracht bij temperaturen van 28 °C-32 °C in vergelijking met fysiologische temperatuur – een fenomeen dat bekend staat als hypothermische inotropie^{45, 46}. okt. De effecten van temperatuur op de functie van gemanipuleerd myocardweefsel blijven echter onderbelicht. Veel recent gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur zijn ontworpen om functioneel te worden beoordeeld bij 37 °C om fysiologische omstandigheden te benaderen 13,14,37. Voor zover wij weten, zijn de temperatuurafhankelijke effecten op de kracht die wordt gegenereerd door gemanipuleerde hartweefsels echter niet systematisch onderzocht. Dit protocol beschrijft een pacing-elektrodeontwerp dat warmteverlies tijdens het testen minimaliseert, en dat de integratie van een geïsoleerd verwarmingselement in de opstelling mogelijk maakt voor functionele metingen, waardoor de hECT’s op fysiologische temperatuur kunnen worden gehouden zonder de steriliteit in gevaar te brengen²⁷. Vervolgens rapporteren we enkele van de waargenomen effecten van temperatuur op de hECT-functie, inclusief op de ontwikkelde kracht, spontane klopfrequentie, +dF/dt en −dF/dt. Al met al biedt dit artikel de details die nodig zijn om dit multi-weefsel krachtgevoelige bioreactorsysteem te vervaardigen om door mensen gemanipuleerde hartweefsels te fabriceren en hun contractiele functie te beoordelen, en er wordt een reeks gegevens gepresenteerd die een vergelijkingsbasis bieden voor metingen bij kamertemperatuur en bij 37 °C²⁷.

Protocol

Dit protocol maakte gebruik van een geanonimiseerde iPSC-lijn, SkiPS 31.3 (oorspronkelijk geherprogrammeerd met behulp van dermale fibroblasten van een gezonde 45-jarige man)47, en was dus vrijgesteld van specifieke goedkeuring door de Institutional Review Board, in overeenstemming met de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de instelling. Voer alle cel- en hECT-manipulatie uit in aseptische omstandigheden in een HEPA-gefilterde klasse II biologische veiligheidskast o…

Representative Results

Volgens het bovenstaande protocol werden cardiomyocyten gegenereerd uit een gezonde iPSC-lijn die eerder door onze groep 9,15 werd gebruikt en na 8-61 dagen in kweek tot hECT’s gefabriceerd. Figuur 9A toont representatieve beelden van hECT’s van onderaf, die zijn gemaakt zonder (boven) en met (onder) SPoT’s. Functionele metingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 °C) en bij fysiologische temperatuur (36 °C) tussen 37 dagen …

Discussion

Er zijn tal van lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen gepubliceerd in de literatuur, waarvan sommige worden beschreven in tabel 1. Sommige modellen omvatten de directe meting van de weefselkracht, maar deze vereisen meestal het overbrengen van het construct naar een apart spierbad³⁸. De meeste modellen zijn ontworpen met de weefsels permanent verankerd aan beide uiteinden, meestal aan PDMS-palen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup cl…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp