Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Summary

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l’analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Abstract

L’insufficienza cardiaca rimane la principale causa di morte in tutto il mondo, creando un urgente bisogno di migliori modelli preclinici del cuore umano. L’ingegneria tissutale è fondamentale per la ricerca cardiologica di base; La coltura cellulare umana in vitro elimina le differenze interspecie dei modelli animali, mentre un ambiente 3D più simile a quello dei tessuti (ad esempio, con matrice extracellulare e accoppiamento eterocellulare) simula le condizioni in vivo in misura maggiore rispetto alla tradizionale coltura bidimensionale su piastre di Petri di plastica. Tuttavia, ogni sistema modello richiede attrezzature specializzate, ad esempio bioreattori progettati su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Inoltre, questi protocolli sono spesso complicati, laboriosi e afflitti dal fallimento dei piccoli e delicati tessuti.

Questo articolo descrive un processo per la generazione di un robusto sistema modello di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano (hECT) utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per la misurazione longitudinale della funzione tissutale. Sei hECT con geometria a striscia lineare vengono coltivati in parallelo, con ogni hECT sospeso da una coppia di perni in polidimetilsilossano (PDMS) con rilevamento della forza collegati ai rack PDMS. Ogni post è dotato di un PDMS stable post tracker (SPoT) nero, una nuova funzionalità che migliora la facilità d’uso, la produttività, la ritenzione dei tessuti e la qualità dei dati. La forma consente un tracciamento ottico affidabile delle deflessioni dei perni, ottenendo un migliore tracciamento della forza di contrazione con tensione attiva e passiva assoluta. La geometria del cappuccio elimina il cedimento del tessuto dovuto agli hECT che scivolano dai perni e, poiché comportano una seconda fase dopo la fabbricazione del rack PDMS, gli SPoT possono essere aggiunti ai progetti basati su post-post PDMS esistenti senza modifiche sostanziali al processo di fabbricazione del bioreattore.

Il sistema viene utilizzato per dimostrare l’importanza di misurare la funzione dell’hECT a temperature fisiologiche e mostra una funzione tissutale stabile durante l’acquisizione dei dati. In sintesi, descriviamo un sistema modello all’avanguardia che riproduce le condizioni fisiologiche chiave per far progredire la biofedeltà, l’efficienza e il rigore dei tessuti cardiaci ingegnerizzati per applicazioni in vitro .

Introduction

I modelli ingegnerizzati di tessuto cardiaco sono disponibili in una vasta gamma di geometrie e configurazioni per ricapitolare vari aspetti della nicchia cardiaca nativa che sono difficili da ottenere con la tradizionale coltura cellulare bidimensionale. Una delle configurazioni più comuni è la striscia di tessuto lineare^, con ancoraggi flessibili a ciascuna estremità per indurre l’autoassemblaggio del tessuto e fornire al tessuto un precarico definito e una lettura delle forze di contrazione risultanti ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. La forza generata può essere determinata in modo robusto attraverso l’inseguimento ottico dell’accorciamento del tessuto e utilizzando la teoria del fascio elastico per calcolare la forza dalle deflessioni misurate e la costante elastica degli ancoraggi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Tuttavia, l’ingegneria dei tessuti cardiaci è ancora un campo in evoluzione e permangono alcune sfide. Per ogni modello di sistema 10,29,30,31 sono necessarie attrezzature specializzate, come bioreattori su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Le dimensioni e la complessità del microambiente di questi costrutti sono spesso limitate da un basso rendimento dovuto a protocolli ad alta intensità di lavoro, dall’elevato numero di cellule e dalla fragilità dei tessuti. Per affrontare questo problema, alcuni gruppi si sono rivolti alla fabbricazione di microtessuti contenenti solo centinaia o migliaia di cellule per facilitare saggi ad alto rendimento utili per la scoperta di farmaci. Tuttavia, questa scala ridotta complica la valutazione accurata della funzione¹², elimina aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa (come i gradienti di diffusione di nutrienti/ossigeno e l’architettura complessa³⁶) e limita la quantità di materiale disponibile per le successive analisi molecolari e strutturali (spesso richiedendo il pooling dei tessuti). La Tabella 1 riassume alcune delle configurazioni dei modelli di strisce di tessuto lineare in letteratura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppo		Cellule per tessuto	Fazzoletti per piastra	Formato piastra		Funzione di ancoraggio		Metodo di acquisizione dei dati funzionali		Bagno multimediale condiviso?	Misura funzionale- mento in situ?
Yoshida (ECT)38		4 milioni	6	Piastra a 6 pozzetti modificata*		trasduttore di forza		Misurazione diretta della forza		No	No
Chan (hESC-CM-ECTs)26		310 mila	6	Piatto personalizzato a 6 pozzetti		Posti PDMS		Misurazione diretta della forza		Sì	No
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 milioni	6	Piatto personalizzato a 6 pozzetti		Filo PDMS		forma del tessuto		No	Sì
RADISIC (BioWire)39, 40		110 mila	8			filo polimerico		Forma del filo		Sì	Sì
Costa (hECT singolo)1, 2		1-2 milioni	4**	Piastra Petri da 10 cm**		Posti PDMS		Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti)		Sì	Sì
Costa (multi-hECT)3–9		500 k-1 milione	6	Piastra di Petri da 6 cm		Posti PDMS		Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti)		Sì	Sì
Costa (multi-hECT con SPoT)		1 milione	6	Piastra di Petri da 6 cm		Pali PDMS con cappucci neri		Deflessione ottica (tracciamento dell’oggetto)		Sì	Sì
Passier (EHT)17		245 mila	36	Piastra a 12 pozzetti		Pali PDMS con cappucci neri		Deflessione ottica (tracciamento dell’oggetto)		Sì	Sì
Vunjak-Novakovic13, 18		1 milione	12	Piastra di Petri da 6 cm		Pali PDMS con tappi		deflessione ottica (rilevamento dei bordi)		Sì	Sì
Vunjak-Novakovic (MilliPilastro)14		550 mila	6	Piatto personalizzato a 6 pozzetti		Pali PDMS con tappi		deflessione ottica (tracciamento di oggetti); Imaging del calcio		No	Sì
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 milione	12	Piastra a 12 pozzetti		Pali PDMS con tappi		deflessione ottica (rilevamento del bordo della post-deflessione); Imaging del calcio		No	Sì
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 mila	96	Piastra a 96 pozzetti		Pali PDMS con ganci		deflessione ottica (rilevamento dei bordi)		No	Sì
Murry23, 24		900 mila	24	Piastra a 24 pozzetti		Pali PDMS con tappi, magnete integrato		sensore magnetico		No	Sì
Reich (μTUG)11, 12, 25		indefinito	156	Piatto da 156 pozzetti		Pali PDMS con tappi, magnete integrato		Tracciamento ottico (perlina fluorescente)		Sì	Sì

Tabella 1: Caratteristiche di alcuni modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare in letteratura. I modelli lineari di tessuto cardiaco ingegnerizzato variano in termini di dimensioni, produttività, design delle caratteristiche di ancoraggio e facilitazione di bagni di terreno condivisi, nonché i requisiti per un sistema di bagno muscolare separato per la caratterizzazione funzionale. * I ricercatori hanno utilizzato un sistema tissutale ingegnerizzato disponibile in commercio basato sulle dimensioni di una piastra standard a 6 pozzetti. ** Un sistema modulare in cui i bioreattori monotissutale sono ancorati a qualsiasi piastra di coltura in plastica nel numero e nella posizione desiderati.

Questo documento descrive l’ultimo protocollo per la fabbricazione del nostro modello consolidato di tessuto cardiaco lineare ingegnerizzato umano (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 e metodi per la valutazione della funzione contrattile dell’eCT. Ogni bioreattore multi-tessuto ospita fino a sei hECT in un bagno di terreno condiviso ed è composto da due pezzi “rack” realizzati con l’elastomero siliconico polidimetilsilossano (PDMS) montato su un telaio rigido in polisulfone. Ogni rack PDMS contiene sei montanti flessibili integrati con rilevamento della forza di 0,5 mm di diametro e 3,25 mm di lunghezza e, insieme, due rack forniscono sei coppie di montanti, ognuno dei quali contiene un hECT. L’inversione del bioreattore aiuta a superare qualsiasi ostacolo alla visualizzazione degli hECT dal basso dovuto alla condensazione dell’acqua dal terreno di coltura o alle distorsioni del menisco dell’interfaccia aria-liquido. Ogni contrazione di un hECT provoca la deflessione dei pali terminali integrati e la misurazione ottica del segnale di deflessione viene elaborata in un tracciato della forza rispetto al tempo che rappresenta la funzione contrattile dell’hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Rispetto ai bioreattori monotissutali tipicamente utilizzati per tessuti di queste dimensioni, il design multi-tessuto migliora la produttività sperimentale e consente lo studio della segnalazione paracrina tra tessuti adiacenti di composizione cellulare potenzialmente diversa. Questo sistema è stato validato in studi pubblicati che descrivono applicazioni nella modellazione della malattia ^4,8, nella segnalazione paracrina ^6,7, nella coltura eterocellulare ^5,9 e nello screening terapeutico ^7,9.

In questo sistema, gli hECT sono progettati per essere lunghi circa 6 mm e con un diametro di 0,5 mm per facilitare un robusto tracciamento ottico delle misurazioni della forza con basso rumore. Inoltre, aspetti della complessità tissutale, come i gradienti di diffusione e l’organizzazione cellulare, sono bilanciati con un fabbisogno gestibile di 1 milione di cellule per tessuto. Con la tecnologia standard delle telecamere CCD, forze deboli come 1 μN (che rappresentano meno di 5 μm di post-deflessione) generano un segnale chiaro, assicurando che anche la funzione contrattile estremamente debole, come osservato con alcuni modelli di malattia hECT, possa essere misurata con precisione. Ciò facilita anche l’analisi dettagliata della curva della forza di contrazione, consentendo così l’analisi ad alto contenuto di un massimo di 16 metriche di contrattilità⁴¹, tra cui la forza sviluppata, i tassi di contrazione (+dF/dt) e di rilassamento (−dF/dt) e la variabilità della frequenza di battimento.

Questo protocollo inizia con le istruzioni per la fabbricazione dei componenti del bioreattore. Particolare attenzione è rivolta alle fasi per massimizzare la resa di hECT, ridurre la variabilità tecnica nella funzione tissutale e ottimizzare la qualità e la profondità della valutazione tissutale. La maggior parte degli studi di ingegneria tissutale cardiaca non riporta i tassi di perdita di tessuto durante la fabbricazione e i test a lungo termine, sebbene sia una sfida ben nota nel campo e riduca la produttività e l’efficienza degli studi²⁷. I metodi di ingegneria tissutale qui descritti sono stati perfezionati nel corso degli anni per garantire la ritenzione di tutti gli hECT nella maggior parte dei bioreattori (indipendentemente da come sono fabbricati i rack PDMS). Tuttavia, anche una perdita del 5%-20% dei tessuti può influenzare significativamente la potenza statistica, in particolare negli esperimenti più piccoli limitati dal numero di cardiomiociti disponibili (ad esempio, a causa di problemi di differenziazione con alcune linee cellulari malate⁴ o a causa dell’alto costo dei cardiomiociti acquistati in commercio), o dalle condizioni di trattamento (ad esempio, disponibilità limitata o costo elevato di vari composti di trattamento).

Questo protocollo descrive la fabbricazione di inseguitori di pali stabili (SPoT), una nuova caratteristica dei rack PDMS, che funzionano come tappi alle estremità dei pali di rilevamento della forza che contengono gli hECT²⁷. È stato dimostrato come la geometria del cappuccio riduca significativamente la perdita di hECT dovuta alla caduta o al distacco dei montanti, aprendo così nuove opportunità per la coltivazione di hECT con una maggiore varietà di rigidità e tensioni, che sono difficili da coltivare su pali non tappati. Inoltre, gli SPoT forniscono un oggetto ad alto contrasto per migliorare l’inseguimento ottico della contrazione hECT attraverso una forma coerente e ben definita²⁷. Segue una descrizione della coltura di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e del differenziamento dei cardiomiociti sulla base dei protocolli ^3,42,43 pubblicati in precedenza e una spiegazione della fabbricazione, della coltura e delle misurazioni funzionali dell’hECT.

Questo articolo affronta anche la necessità di misurare la funzione dei tessuti alla temperatura fisiologica. Il miocardio umano (tessuto sano e malato fetale e adulto), così come il tessuto cardiaco di un’ampia gamma di specie animali (tra cui ratti, gatti, topi, furetti e conigli)^44,45, mostra un marcato aumento della forza di contrazione abbinata alla frequenza a temperature di 28 °C-32 °C rispetto alla temperatura fisiologica, un fenomeno noto come inotropia ipotermica^{45, 46}. Tuttavia, gli effetti della temperatura sulla funzione del tessuto miocardico ingegnerizzato rimangono poco studiati. Molti recenti modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato in letteratura sono progettati per essere valutati funzionalmente a 37 °C per approssimare le condizioni fisiologiche 13,14,37. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, gli effetti dipendenti dalla temperatura sulla forza generata dai tessuti cardiaci ingegnerizzati non sono stati studiati in modo sistematico. Questo protocollo descrive un design dell’elettrodo di stimolazione che riduce al minimo la perdita di calore durante il test, oltre a consentire l’incorporazione di un elemento riscaldante isolato nella configurazione per le misurazioni funzionali, in grado di mantenere gli hECT a temperatura fisiologica senza compromettere la sterilità²⁷. Riportiamo quindi alcuni degli effetti osservati della temperatura sulla funzione dell’hECT, tra cui la forza sviluppata, la frequenza di battimento spontaneo, +dF/dt e −dF/dt. Nel complesso, questo documento fornisce i dettagli necessari per produrre questo sistema di bioreattore multi-tessuto con rilevamento della forza per fabbricare tessuti cardiaci ingegnerizzati dall’uomo e per valutare la loro funzione contrattile, e viene presentata una serie di dati che forniscono una base di confronto per le misurazioni a temperatura ambiente e a 37 °C²⁷.

Protocol

Questo protocollo utilizzava una linea iPSC de-identificata, SkiPS 31.3 (originariamente riprogrammata utilizzando fibroblasti dermici di un maschio sano di 45 anni)47, ed era, quindi, esente dall’approvazione specifica dell’Institutional Review Board, in conformità con le linee guida del comitato etico per la ricerca umana dell’istituzione. Eseguire tutta la manipolazione delle cellule e dell’hECT in condizioni asettiche in una cabina di sicurezza biologica di classe II filtrata HEPA o in un ban…

Representative Results

Seguendo il protocollo di cui sopra, i cardiomiociti sono stati generati da una linea di iPSC sana utilizzata in precedenza dal nostro gruppo 9,15 e fabbricati in hECT dopo 8-61 giorni in coltura. La Figura 9A mostra immagini rappresentative degli hECT visti dal basso, che sono stati creati senza (in alto) e con (in basso) SPoT. Le misurazioni funzionali sono state effettuate a temperatura ambiente (23 °C) e a temperatura fisiologic…

Discussion

Esistono numerosi modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare pubblicati in letteratura, alcuni dei quali sono descritti nella Tabella 1. Alcuni modelli prevedono la misurazione diretta della forza tissutale, ma in genere richiedono il trasferimento del costrutto in un bagno muscolare separato³⁸. La maggior parte dei modelli sono progettati con i tessuti ancorati in modo permanente ad entrambe le estremità, più comunemente ai perni PDMS …

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp