Summary

Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

Published: January 13, 2023
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Abstract

Este artigo descreve um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD), chamado PhotoACT. O dispositivo foi construído usando um conjunto de diodos emissores de luz programáveis convencionais (LEDs), um módulo de display de cristal líquido (LCD) e um sensor de luz conectado a uma placa microcontroladora comercial. A estrutura baseada em caixa do protótipo foi feita com painéis de fibra de média densidade (MDFs). O compartimento interno pode alocar simultaneamente quatro microplacas multipoços de cultura celular.

Como prova de conceito, estudamos o efeito citotóxico do fotossensibilizador (PS) verteporfina contra a linhagem celular HeLa em cultura bidimensional (2D). As células HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de verteporfina por 24 h. O meio sobrenadante contendo fármaco foi descartado, as células aderentes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio livre de drogas foi adicionado. Neste estudo, o efeito da verteporfina nas células foi examinado sem exposição à luz ou após exposição por 1 h à luz usando valores vermelho-verde-azul (RGB) de 255, 255 e 255 (fluência média de 49,1 ± 0,6 J/cm2). Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

Os resultados experimentais mostraram que a exposição das células tratadas com verteporfina à luz do dispositivo aumenta o efeito citotóxico da droga através de um mecanismo mediado por espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o uso do protótipo descrito neste trabalho foi validado comparando-se os resultados com um dispositivo PDT comercial. Assim, este protótipo de terapia fotodinâmica à base de LED representa uma boa alternativa para estudos in vitro de TFD.

Introduction

Entre as doenças não transmissíveis mais letais, o câncer representa uma das principais causas globais de morte prematura. Foi responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020, representando cerca de uma em cada seis mortes em todo o mundo1. Além disso, o fenômeno da multirresistência (MDR) representa uma tremenda ameaça à saúde pública, uma vez que os protocolos quimioterápicos aprovados não atingem os estágios de remissão para essa condição clínica2. As células cancerosas podem desenvolver resistência à quimioterapia através de vários mecanismos; no entanto, a superexpressão de alguns transportadores de de ligação a ATP (ABC) – bombas de efluxo dependentes de ATP – é considerada a principal causa do desenvolvimento de MDR dentro de um microambiente tumoral3. Além da MDR, outras complicações do câncer, como recidiva e metástase, reforçam a demanda urgente de desenvolver e aprimorar abordagens terapêuticas para superar esse desafio oncológico.

A utilização curativa da luz tem sido praticada há séculos4, e a terapia fotodinâmica (TFD) representa uma abordagem terapêutica clinicamente aprovada para tumores sólidos. A TFD combina a administração de um fotossensibilizador (PS) seguido de irradiação de luz para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) para exercer citotoxicidade seletiva em células tumorais. Essa abordagem terapêutica é superior aos métodos convencionais, incluindo cirurgia, radiação e quimioterapia5; é uma técnica minimamente invasiva que apresenta menor citotoxicidade nos tecidos conjuntivos6. A aplicação de luz e o acúmulo de PS diretamente no tumor ou em seu microambiente garantem direcionamento preciso e, consequentemente, efeitos colaterais sistêmicos menores e indesejáveis7 e a possibilidade de tratamento repetido no mesmo local. Além disso, o custo é menor do que o de outras abordagens. Devido às suas características promissoras, a TFD pode ser considerada uma opção adequada tanto para a doença isolada, principalmente no caso de tumores inoperáveis, quanto para o tratamento adjuvante docâncer7, e representa uma alternativa para a MDR relacionada à quimioterapia 8,9.

O primeiro relato mostrando uma alta taxa de resposta objetiva usando PDT foi descrito em 1975 em um rato e rato modelo10. Desde então, estudos têm sido realizados utilizando TFD com desfechos positivos7 in vivo e in vitro com linhagens celulares tumorais humanas em cultura de células 2D11,12. Considerando a ampla aplicabilidade do PS clinicamente aprovado, independentemente de suas vias de acumulação específicas e faixas de comprimento de onda dos picos de absorção, o processo geral é o seguinte: (i) captação de PS, (ii) pico de concentração de PS no tumor ou em seu microambiente, (iii) aplicação de luz, (iv) interação PS-luz, (v) transferência de energia de estado excitada de PS para o substrato tecidual ou moléculas de oxigênio circundantes, (vi) produção de ERO envolvendo oxigênio singlete ou ânion superóxido, (vii) morte de células tumorais via, essencialmente, necrose ou apoptose (morte direta), autofagia (mecanismo citoprotetor), isquemia tecidual (dano vascular), modulação imunológica ou sobreposição desses mecanismos7. Nessa etapa final, a ativação de uma via específica de morte celular depende de muitos fatores, como características celulares, delineamento experimental e, mais importante, localização intracelular da PS e dano direcionado relacionado à TFD13.

A verteporfina é um PS de segunda geração, aprovado por agências reguladoras para uso clínico na Noruega e na China para tratar a degeneração macular relacionada à idade7. Após a administração da dose, foi relatado que esse pró-fármaco se acumula parcialmente nas mitocôndrias14 e induz fosforilação da proteína tirosina celular e fragmentação do DNA, levando à apoptose das células tumorais15,16. Após 24 h de incubação para internalização da verteporfina, recomenda-se um protocolo PDT utilizando uma configuração de comprimento de onda de 690 nm para atingir níveis efetivos de transferência de radiação eletromagnética para moléculas adjacentes 7,17.

Em relação à fonte de luz para TFD, os sistemas clássicos de laser de diodo geralmente são caros, tecnicamente complicados, superdimensionados e, portanto, não portáteis18,19. Como consequência de seu perfil de comprimento de onda único, que também pode ser observado em equipamentos PDT baseados em LED, a demanda por unidades independentes para cada aplicação de fotossensibilizador torna a utilização de sistemas de laser de diodo ainda mais complexa e economicamente inviável20,21. Portanto, a utilização de máquinas de LED é considerada a alternativa mais promissora para resolver não apenas os custos22 e problemas de manutenção, mas também para proporcionar alta potência de saída e menos prejudicial 23 e maior capacidade de iluminação 24,25,26,27.

Apesar da contribuição potencial que os equipamentos baseados em LED podem oferecer para os experimentos de TFD28, a maioria das opções comerciais ainda possui desvantagens, como falta de portabilidade, alto custo e projetos e operações de construção e operação complexos29. O principal objetivo deste trabalho foi oferecer uma ferramenta simples e confiável para ensaios de TFD in vitro . Este artigo descreve o PhotoACT, um dispositivo PDT baseado em LED construído internamente, que é barato, fácil de usar e portátil. Como prova de conceito, este dispositivo é mostrado para aumentar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D e, portanto, pode ser usado como uma ferramenta de pesquisa em experimentos de PDT.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo. 1. Construção do dispositivo Serra de 3 mm de espessura de painéis de fibra de média densidade (MDF) para obtenção de peças com as dimensões mostradas na Figura 1A.Observação : use o arquivo vetorial (arquivo suplementar 1) para o corte de controle numéri…

Representative Results

O dispositivo PDT final, chamado de PhotoACT, incluía uma câmara escura para alocar até quatro microplacas multipoço, com sua superfície interna superior equipada com um conjunto de 30 LEDs dispersos programados para emitir espectros distintos de luz visível (Figura 3 e Arquivo Suplementar 6). O dispositivo foi construído utilizando duas caixas associadas: uma caixa interna projetada como uma câmara escura para os ensaios de PDT e uma caixa externa para cobrir a câm…

Discussion

O dispositivo PhotoACT final foi conveniente para construir com componentes de baixo custo disponíveis comercialmente a um custo total de menos de US $ 50. As vantagens adicionais incluem baixas demandas de manutenção, a capacidade de irradiar vários tipos de placas de cultura, o uso simultâneo de até quatro unidades por ensaio, baixo peso (2 kg)/tamanho (44 cm3) que permite portabilidade, irradiação precisa e reprodutível (dados não mostrados) e uma interface de configuração simples e fácil de us…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Arthur Henrique Gomes de Oliveira e Lucas Julian Cruz Gomes por ajudarem no processo de filmagem. Este projeto contou com o apoio do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq, número de bolsas 400953/2016-1-404286/2021-6) e da Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Este estudo também foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código Financeiro 001.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

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Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G., Prado, L. d. O., Zattoni, I. F., Da Paz, G., Prado, A. L. d., Volanski, W., Lavarda, M. D., Rego, F. G. d. M., Picheth, G., Moure, V. R., Valdameri, G. An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model. J. Vis. Exp. (191), e64391, doi:10.3791/64391 (2023).

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