Denne protokollen gir metoder for å generere 3D-konstruerte hjerte- og skjelettmuskulaturvev og beskriver deres bruk i prekliniske legemiddelscreeningsmodaliteter. De beskrevne metodene benytter et magnetisk sensorsystem for å lette samtidig vurdering av 24 vev parallelt.
Nøyaktig modellering av friske og sykdomstilstander in vitro er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsstrategier og terapier. For hjerte- og skjelettmuskelsykdommer utgjør kontraktil kraft og kinetikk nøkkeltall for vurdering av muskelfunksjon. Nye og forbedrede metoder for å generere konstruerte muskelvev (EMT) fra induserte pluripotente stamceller har gjort in vitro sykdomsmodellering mer pålitelig for kontraktilt vev; Imidlertid er reproduserbar fremstilling av vev fra suspenderte cellekulturer og måling av kontraktiliteten utfordrende. Slike teknikker er ofte plaget med høye feilrater og krever kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny plattform og enhet som bruker 3D-EMT-er sammen med en etikettfri, svært parallell og automatiseringsvennlig kontraktilitetsanalyse omgår mange av disse hindringene. Plattformen muliggjør enkel og reproduserbar fabrikasjon av 3D-EMT-er ved bruk av praktisk talt alle cellekilder. Vevskontraktilitet måles deretter via et instrument som samtidig måler 24 vev uten behov for komplekse programvareanalyserutiner. Instrumentet kan på en pålitelig måte måle mikronewtonendringer i kraft, noe som muliggjør doseavhengig sammensatt screening for å måle effekten av et legemiddel eller terapeutisk på kontraktil utgang. Konstruerte vev laget med denne enheten er fullt funksjonelle, genererer rykninger og tetaniske sammentrekninger ved elektrisk stimulering, og kan analyseres i lengderetningen i kultur over uker eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT under akutt og kronisk dosering med kjente toksiske stoffer, inkludert et legemiddel (BMS-986094) som ble trukket fra kliniske studier etter pasientdødsfall på grunn av uventet kardiotoksisitet. Endret skjelettmuskulaturfunksjon i konstruert vev som respons på behandling med en myosinhemmer presenteres også. Denne plattformen gjør det mulig for forskeren å integrere komplekse, informasjonsrike bioengineered modellsystemer i deres arbeidsflyt for narkotikaforskning med minimal tilleggsopplæring eller ferdigheter som kreves.
Induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) blir i økende grad sentrale aktører i den prekliniske rørledningen for terapeutisk oppdagelse og utvikling, samt grunnleggende biologisk forskning og sykdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt vev, som hjerte- og skjelettmuskulatur avledet fra iPSCs, har stort potensial for å forbedre den prediktive kraften til humane in vitro-studier, da direkte vurdering av muskelkontraktil kraft og kinetikk er kvantitative beregninger for å studere total vevsfunksjon 4,6,7,8. Vanligvis har målinger av kontraktil kraft blitt oppnådd enten indirekte ved optisk sporing av substratavbøyning 9,10 eller direkte ved festing av celler / vev til en krafttransduser4,11,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige, har iboende lav gjennomstrømning og krever vanligvis dyktige operatører for å samle inn og analysere data.
Tidligere arbeid har vist at magnetfeltføling omgår disse hindringene og gir en alternativ metode for å vurdere konstruert muskelfunksjon samtidig over flere vevskonstruksjoner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologien ved hjelp av en enhet som er i stand til å måle kontraktiliteten til konstruerte muskelvev på en svært parallell måte som utnytter kompleksiteten til 3D-cellulære modeller med høyere gjennomstrømningsscreening14. Plattformen muliggjør etikettfri, kvantitativ, sanntidsovervåking av kontraktil funksjon i hjerte- og skjelettmuskulaturvev i eller utenfor en standard cellekulturinkubator, og eliminerer behovet for optisk-basert kontraktil avbildning og analyse. Denne teknologien muliggjør direkte sammenligning av friske og syke cellelinjer og muliggjør måling av et legemiddels effekt på kontraktilt vev, etablering av kvantifiserbare, in vitro, sikkerhets- og effektdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstruert 3D-muskelvev kan fremstilles mellom to stolper på en svært reproduserbar måte ved hjelp av Mantarray forbruksvare, 24-brønns støpeplate (figur 1). Det ene innlegget er stivt, mens det andre innlegget er fleksibelt og inneholder en liten magnet. Når vevskonstruksjonen trekker seg sammen, fortrenger den den fleksible stolpen og den innebygde magneten. EMT-platen er plassert i instrumentet, og etter forskyvning måles via en rekke magnetiske sensorer på et kretskort under plateholderen. De målte endringene i magnetfeltet omdannes til absolutt kontraktil kraft ved hjelp av en matematisk algoritme. Instrumentet benytter raske datasamplingshastigheter for å muliggjøre innsamling av detaljert informasjon om funksjonell kapasitet og modenhet av celletypen (e) som analyseres, inkludert sammentrekningsfrekvens, hastighet og forfallstid. Disse funksjonelle målingene kan oppnås på tvers av alle 24 brønner samtidig med magnetisk sensorplattform eller individuelt og sekvensielt ved hjelp av tradisjonelle optiske metoder.
Denne studien beskriver en svært reproduserbar metode for engineering 3D skjelettmuskulatur og hjerte mikrovev i en fibrinbasert hydrogel. Under en kort, 80-minutters reaksjon katalyserer trombin omdannelsen av fibrinogen til fibrin, og gir et stillas for muskelceller å utvikle seg i suspendert kultur15. Stromale celler hjelper til med å omforme matrisen og vev blir kontraktile ettersom muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten til disse vevene ble analysert ved hjelp av magnetisk sensing-tilnærming, både før og etter sammensatt eksponering, og validerte denne modaliteten for bruk i dose-respons-legemiddelstudier. Primære humane myoblaster fra en frisk donorbiopsi ble oppnådd kommersielt og dyrket i 2D i henhold til leverandørens protokoller. Celler ble utvidet ved hjelp av et skjelettmuskulaturvekstmedium gjennom tre passasjer for å generere tilstrekkelige cellenumre til å fremstille 3D-vev. Stromale celler og hiPSC-avledede kardiomyocytter ble dyrket i henhold til leverandørens protokoll i 3 dager for å tillate utvinning fra kryopreservering før støping av celler i vev. Representative resultater er gitt som illustrerer hvilke typer datasett som kan samles inn ved hjelp av magnetisk sensorplattform. Vanlige fallgruver forbundet med generering av konstruerte vev ved hjelp av disse metodene blir også adressert.
Denne studien beskriver metoder for å generere 3D-konstruert hjerte- og skjelettmuskulaturvev i et 24-brønns forbrukssett. Ved å følge disse metodene er det mulig å konsekvent oppnå et komplett utvalg av 24 vev uten støpefeil for påfølgende legemiddelscreening. Kritiske hensyn for å oppnå et slikt resultat er å sikre at under støping utføres alle trinnene på is for å forhindre for tidlig polymerisering av hydrogelene, fjerning av celledissosiasjonsreagens før vevstøping, grundig blanding av cellen og hydrogelsuspensjonen for hvert vev, utskifting av pipettespisser mellom vev og bruk av varmeinaktivert FBS (hvis det brukes i det hele tatt). Det er også viktig å sikre at stolpegitteret ikke flyttes når støpingen starter og overføres forsiktig når hydrogeler har dannet seg.
Store modifikasjoner inkluderer bruk av forskjellige celletyper for å oppnå hjerte versus skjelett-EMT og doping av hydrogeler med variable konsentrasjoner av kjellermembranproteiner for å fremme cellulær modning og vevsstabilitet. De gunstige effektene av slik doping må testes i hvert enkelt tilfelle, men har vist seg å forbedre funksjonelle utfall og vevets levetid under visse omstendigheter14,16,22. Det er også bemerkelsesverdig at celletetthetene som er oppført, er en veiledning og kanskje må optimaliseres for forskjellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensetninger kan også betraktes som et middel til å modifisere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til de oppnådde EMTene23,24,25. Det opprinnelige muskelmikromiljøet inneholder også støttende celletyper for å fremme vaskularisering, innervering og matriksavsetning for å støtte myocytter i form og funksjon26,27. Mens systemet beskrevet her for tiden inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevev, kan flere celletyper skape en mer fysiologisk relevant modell for å studere sikkerheten og effekten av terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere har en rekke støttende celletyper blitt integrert i 3D-konstruerte vev som presenterer en spennende mal for fremtidig studie ved hjelp av magnetisk sensing kontraktilitetsplattform28,29,30.
Feilsøking for denne protokollen fokuserer på dannelsen av upålitelige eller inkonsekvente vev under støpeprosessen. Det må utvises forsiktighet for å unngå bobledannelse i hydrogelene ettersom de støpes, samtidig som det letter jevn fordeling av cellene under blanding. Optimaliseringseksperimenter vil trolig være nødvendig for hver ny celletype for å identifisere ideelle celletettheter, celleforhold og matrisesammensetning.
En stor begrensning for denne teknikken er det betydelige antallet celler som kreves for å etablere en full plate med 24 EMT. For dataene som presenteres her, ble det brukt 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skjelettmyoblaster per plate. Enkelte forskere har kanskje ikke tilgang til så store bassenger av cellulært materiale, noe som kan hemme deres evne til å bruke denne plattformen i sin fulle utstrekning. Hvis sluttbrukere ikke har tilgang til magnetisk sensormaskinvare, må målinger av etteravbøyninger utføres optisk, noe som reduserer gjennomstrømningen betydelig og forhindrer samtidig registrering av muskelkontraksjoner over flere brønner. Mantarray-maskinvaren overvinner imidlertid disse begrensningene for å tilby det første kommersielle systemet som er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse av EMT-sammentrekning samtidig på tvers av flere konstruksjoner.
Magnetisk sensing over 24 brønner muliggjør langsgående studier av EMT-funksjonell utvikling i sanntid og muliggjør nøyaktig måling av akutte responser på kjemisk, miljømessig eller genetisk manipulasjon. Mens magnetisk sensing har flere fordeler, for eksempel samtidig måling over flere vev, og ikke krever komplisert dataanalyse, muliggjør optiske deteksjonsmetoder samtidig måling av fysiologiske beregninger som kalsiumfluks eller spenningskartlegging. Imidlertid viser datasett som de som er illustrert i resultatseksjonen bredden av applikasjoner denne teknologien har i stoffutviklingsområdet. Gitt at få analyser på markedet gir midler til å utføre en direkte vurdering av kontraktil produksjon i konstruert muskel, holder disse metodene potensialet til å revolusjonere den prekliniske utviklingsrørledningen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og ved finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjelp med utarbeidelsen av dette manuskriptet.
100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
Dnase | Sigma | 11284932001 | |
DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |