Her presenterer vi en protokoll for in vitro-utvelgelse av konstruerte transkripsjonsrepressorer (ETR) med høy, langsiktig, stabil, on-target silencing effektivitet og lav genom-bred, off-target aktivitet. Denne arbeidsflyten gjør det mulig å redusere et innledende, komplekst repertoar av kandidat-ETR til en kort liste, egnet for videre evaluering i terapeutisk relevante innstillinger.
Geninaktivering er medvirkende til å studere genfunksjon og representerer en lovende strategi for behandling av et bredt spekter av sykdommer. Blant tradisjonelle teknologier lider RNA-interferens av delvis målopphevelse og kravet om livslang behandling. I motsetning til dette kan kunstige nukleaser pålegge stabil geninaktivering gjennom induksjon av et DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB), men nyere studier stiller spørsmål ved sikkerheten til denne tilnærmingen. Målrettet epigenetisk redigering via konstruerte transkripsjonsrepressorer (ETR) kan representere en løsning, da en enkelt administrering av spesifikke ETR-kombinasjoner kan føre til varig deaktivering uten å indusere DNA-brudd.
ETR er proteiner som inneholder et programmerbart DNA-bindende domene (DBD) og effektorer fra naturlig forekommende transkripsjonsrepressorer. Spesielt ble en kombinasjon av tre ETRer utstyrt med KRAB-domenet til humant ZNF10, det katalytiske domenet til humant DNMT3A og humant DNMT3L, vist å indusere arvelige repressive epigenetiske tilstander på ETR-målgenet. Hit-and-run-naturen til denne plattformen, mangelen på innvirkning på DNA-sekvensen til målet, og muligheten til å gå tilbake til den undertrykkende tilstanden ved DNA-demetylering på forespørsel, gjør epigenetisk silencing til et spillskiftende verktøy. Et kritisk skritt er identifisering av riktig ETRs posisjon på målgenet for å maksimere on-target og minimere off-target silencing. Å utføre dette trinnet i den endelige ex vivo eller in vivo prekliniske innstillingen kan være tungvint.
Ved å ta CRISPR / katalytisk død Cas9-systemet som en paradigmatisk DBD for ETR, beskriver denne artikkelen en protokoll som består av in vitro-skjermen av guide-RNA (gRNA) koblet til trippel-ETR-kombinasjonen for effektiv on-target silencing, etterfulgt av evaluering av genom-wide spesifisitetsprofilen til topptreff. Dette muliggjør reduksjon av det opprinnelige repertoaret av kandidat-gRNA til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet for deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante innstillingen av interesse.
Geninaktivering har tradisjonelt spilt en nøkkelrolle for å studere genfunksjon i både cellulære og dyremodeller. Videre, i de siste to tiårene, med fremveksten av genterapi, har det blitt foreslått som en potensielt spillskiftende tilnærming til å behandle sykdommer forårsaket av gevinst-av-funksjon mutasjoner1, smittsomme sykdommer2 eller patologier der deaktivering av ett gen kan kompensere for en arvelig defekt i en annen3. Endelig har genetisk inaktivering av nøkkelregulatorer for cellekondisjon og funksjonell kontroll blitt foreslått for å øke effektiviteten av celleprodukter for kreftimmunterapi4 og regenerativ medisin5.
Blant de forskjellige teknologiene for å oppnå geninaktivering, er en av de mest lovende målrettet epigenetisk inaktivering 6,7. Kjernen i denne teknologien er de såkalte konstruerte transkripsjonsrepressorene (ETR), kimære proteiner som består av et programmerbart DNA-bindende domene (DBD) og et effektordomene (ED) med epigenetisk repressiv funksjon. Zinkfingerproteiner (ZFPs)8, transkripsjonsaktivatorlignende effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserte DBD-er kan utformes for å selektivt binde ED til promotor/forsterkersekvensen til målgenet som skal deaktiveres. En gang der utfører ED av ETR sin silencing aktivitet ved å pålegge heterokromatin-induserende repressive epigenetiske merker som histonmodifikasjoner (H3K9 11,12 eller H3K27 13 metylering, H3 eller H4 deacetylering 14) og CpG DNA-metylering 15, i henhold til det repressive domenet som brukes.
Spesielt inspirert av de molekylære prosessene for permanent transkripsjonell undertrykkelse av endogene retrovirus som forekommer i preimplantasjonsembryoet16, har en kombinasjon av tre ETR blitt generert for å utnytte følgende ED: i) Krüppel-assosiert boks (KRAB) domene av human ZNF10; ii) det katalytiske domenet til human de novo DNA-metyltransferase 3A (DNMT3A); og iii) full-lengde humant DNA metyltransferase 3-lignende (DNMT3L). KRAB er et konservert repressivt domene som deles av flere ZFP-er hos høyere virveldyr17,18, hvis silencingaktivitet hovedsakelig er basert på dets evne til å rekruttere KAP1 19-et stillasprotein som deretter interagerer med flere andre heterokromatinduktorer20-som omfatter nukleosomremodellering og deacetylering (NuRD) kompleks 21, H3K9 histonmetyltransferase SETDB1 22 og H3K9-metyleringsleseren HP1 23, 24, blant annet.
DNMT3A overfører aktivt metylgrupper på DNA ved CpG-sekvenser25. Den katalytiske aktiviteten til DNMT3A forsterkes av dens fysiske tilknytning til DNMT3L, en embryo- og kimcellebegrenset paralog av DNMT3A som mangler det katalytiske domenet som er ansvarlig for metylgruppeoverføring26,27. DNA-metylering ved CpG-rike regioner – referert til som CpG-øyer (CGI) – innebygd i promotor / forsterkerelementene i pattedyrgener er vanligvis forbundet med transkripsjonsdemping28. Det er viktig at når den er deponert, kan CpG-metylering arves stabilt gjennom mitose av et UHRF1-DNMT1-basert molekylært kompleks29.
Stabil overekspresjon av ETR i målcellen kan være problematisk, sannsynligvis på grunn av den økende risikoen for aktivitet utenfor målet og squelching av endogene interaktorer fra deres fysiologiske målsteder over tid. Imidlertid kan forbigående uttrykk for enkelt-ETR-deler mislykkes i å indusere langvarig deaktivering med høy effektivitet30, noe som hemmer deres terapeutiske anvendelse. Derfor var et banebrytende gjennombrudd i feltet beviset på at kombinasjonen av de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserte ETRene kan synergisere og, selv når de bare er forbigående levert samtidig, pålegge promotorsekvensen av målgenet H3K9 og CpG-metylering. Disse blir deretter lest og forplantet av cellen gjennom mitose, noe som fører til arvelig silencing i flere humane og murine cellelinjer, samt ex vivo dyrkede primære celler30.
Merk at den epigenetiske deaktiveringen pålagt av ETR-ene kan tilbakeføres på forespørsel ved målrettet (f.eks. rekruttering av CRISPR / dCas9-basert TET1 DNA-demetylase på det lydløse stedet) eller farmakologisk (administrering av DNA-metyltransferasehemmeren 5-Aza) DNA-demetylering30, en potensiell motgift i tilfelle ETR-relaterte bivirkninger. Alt-i-ett-ETR med de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserte ED-ene ble også beskrevet, noe som viser signifikant deaktiveringseffektivitet i cellelinjer31,32 mot det store flertallet av proteinkodende gener. Videre rapporterte flere studier som brukte ETRene en høy sikkerhetsprofil, uten større aktivitet utenfor målet når det gjelder de novo CpG-metylering eller endring av kromatintilgjengelighet30,31,32. Imidlertid anbefales en dedikert analyse av spesifisitetsprofilen til ETR utstyrt med en nydesignet DBD før kliniske anvendelser.
Fra et klinisk perspektiv kan målrettet epigenetisk silencing gi kritiske fordeler for både RNA-interferens (RNAi)-basert knockdown33 og kunstig nukleasebasert genforstyrrelse8. I motsetning til RNAi kan målrettet epigenetisk silencing indusere full opphevelse av målet per celle og krever ikke periodisk behandling for å sikre langvarig silencing; i motsetning til genforstyrrelser, etterlater den DNA-sekvensen uendret, og unngår generering av DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB). DSB kan da indusere apoptose og cellesyklusstans, noe som potensielt kan føre til en seleksjon mot celler med en funksjonell p53-bane 34,35 og, spesielt i multiplex genredigeringsinnstillinger, kromosomale omorganiseringer35. Videre, ved å videresende det irreversible mosaikkutfallet av ikke-homologt-ende-sammenføyende-mediert DNA DSB-reparasjon36, kan genforstyrrelser ikke unngå reparasjon av målet i rammen til funksjonelle kodingssekvenser som et av de endelige utfallene, og i motsetning til epigenetisk deaktivering, kan det ikke slettes på forespørsel.
Endelig har epigenetisk silencing potensialet til å utvide rekkevidden av målrettede genetiske elementer til klasser helt eller i det minste delvis ildfaste mot RNAi og genforstyrrelser, for eksempel ikke-transkriberte regulatoriske elementer og ikke-kodende RNA30,32. Det første kritiske trinnet for enhver målrettet epigenetisk deaktiveringsapplikasjon er å designe et panel av ETR som dekker de forskjellige regulatoriske sekvensene av målgenet og identifisere de best presterende seg. Antall ETR som skal testes kan være avgjørende, med tanke på den økende delen av genomet som kan målrettes av de programmerbare DNA-bindingsteknologiene som stadig er under utvikling37. Å utføre skjermen av ETRene direkte på celletypen for terapeutisk å stille målgenet, vil representere det mest relevante alternativet. Imidlertid kan skjermer med høy gjennomstrømning være teknisk tungvint i primære celler på grunn av deres begrensede overlevelse i kultur og deres ofte suboptimale tekniske kapasitet. Store skjermer kan være enda mer ugjennomførbare in vivo.
Et mer praktisk alternativ består i å utføre en innledende screening av et stort panel av ETR i lett konstruerbare cellelinjer først, og deretter bare validere de mest lovende i terapeutisk relevant celletype. Et parallelt problem er valget av en passende avlesning for å måle deaktiveringseffektiviteten til ETR-ene. Direkte vurdering av transkript- eller proteinnivåene til målgenet ved RT-qPCR, western blot eller ELISA kan være kostbart og tidkrevende og kan mangle tilstrekkelig følsomhet, og dermed begrense deres anvendelse på skalaer med høy gjennomstrømning. Genereringen av ad hoc-konstruerte reportercellelinjer der en fluorofor er plassert under transkripsjonskontroll av regulatoriske sekvenser av målgenet, tillater utnyttelse av den flowcytometribaserte tilnærmingen til å lese epigenetisk silencing på enkeltcellenivå og i høyt gjennomstrømningstempo.
Etter disse generelle betraktningene beskriver denne artikkelen en protokoll som består av in vitro-arrayed screen av ETR for on-target silencing efficiency, etterfulgt av evaluering av den genombrede off-target-aktiviteten til topptreffene. Denne arbeidsflyten gjør det mulig å redusere det opprinnelige repertoaret av kandidat-ETR til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet for deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante celletypen av interesse.
Blant de forskjellige programmerbare DBD-ene som kan utnyttes til å generere ETR, vil denne protokollen fokusere på CRISPR / dCas9-basert teknologi på grunn av den enkle utformingen av gRNA som spenner over målgenpromotoren på en høy gjennomstrømningsskala. Den samme konseptuelle arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor, kan imidlertid vedtas for å evaluere effektiviteten og spesifisiteten til ETR-er utstyrt med andre DBD-er.
Målrettet epigenetisk inaktivering kan representere en lovende løsning for å behandle lidelser som kan dra nytte av permanent geninaktivering, inkludert sykdommer forårsaket av gain-of-function-mutasjoner1, smittsomme sykdommer2 og patologier der deaktivering av ett gen enten kan kompensere for en arvelig defekt i en annen3 eller frigjøre det fulle potensialet for adoptivcelleterapier4, 5. Ved å virke på kromatinnivå og bli automatisk forplantet av cellen 7,30,32, kan epigenetisk silencing unngå giftige endringer (f.eks. kromosomale omorganiseringer) av DNA-sekvensen til målgenet og delvis, forbigående deaktivering av målet, som er begrensninger av henholdsvis kunstig nukleasebasert genforstyrrelse8,34,35 og RNAi-basert knockdown 33.
Et av de viktigste foreløpige trinnene i enhver epigenetisk silencing-protokoll er å identifisere riktig posisjon på målgenet for å lede ETRene som vil deponere de repressive epigenetiske merkene som er nødvendige for å slå av transkripsjonsaktiviteten til målet. Ulike transkripsjonelle startsted-proksimale og -distale regulatoriske elementer kan sammenfalle for å støtte transkripsjonsutgangen av et gitt humant gen54. Videre kan forskjellige målsteder per spesifikt regulatorisk element nå identifiseres takket være det økende antallet programmerbare DNA-bindingsteknologier6. Derfor kan protokoller, som den som er beskrevet her i konstruerte cellelinjer, brukes til å nominere individuelle målsteder og / eller genomiske regioner som er mottagelige for ETR-mediert epigenetisk deaktivering, før du går i gang med tungvint og tidkrevende evalueringsarbeid av de beste kandidatene i den endelige terapeutiske innstillingen. Noen kritiske aspekter ved protokollen er nærmere beskrevet nedenfor.
Konstruksjon av en reportercellelinje som forutsier det endelige terapeutiske målet
Til tross for den konstante optimaliseringen av celletekniske protokoller – som kreves her for å sette inn kassettkodingen for den fluorescerende reporteren i målgenet og for å levere ETR-ene, kan det ikke tas for gitt at de allerede kan være tilgjengelige for cellelinjen som ligner mest på det endelige terapeutiske målet mest. I dette tilfellet kan forskjellige avbøtende strategier brukes: a) dra nytte av optimaliseringssett levert av leverandører for å optimalisere internt transfeksjonsprotokollen for målcellelinjen; b) bytte til andre cellelinjer som fortsatt uttrykker dette målgenet, men som tilhører andre vev enn det endelige terapeutiske målet – for hvilke ingeniørprotokoller har blitt omfattende optimalisert. I tilfelle disse alternativene ikke er tilgjengelige, kan man vurdere å bytte til primære celletyper eller organoider som representerer det endelige målet. Som en generell vurdering for både prekliniske studier og terapeutiske anvendelser av ETR-basert epigenetisk inaktivering, bør scenarier der målgenet er essensielt for målcelletypen forkastes. Den fullstendige, langsiktige silencing av et essensielt gen pålagt av ETR vil føre til motvalg av målcellene over tid (og potensielt toksisitet av behandlingen). Alternative teknologier som gir delvis målavbrudd, som RNAi33, foretrekkes i disse tilfellene.
Evaluering av ETRs on-target silencing aktivitet
ETR basert på kombinasjonen av KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomener har vist seg å være effektive mot det store flertallet av proteinkodende gener, med et bredt rundt 1 kilobase langt tillatt målrettingsvindu sentrert på transkripsjonsstartstedet32. For å få en følelse av hvordan et godt utført epigenetisk silencing eksperiment ser ut, er de tekniske detaljene og resultatene av å slå av B2M-genet i K-562-celler gitt her. Dette kan betraktes som en viktig positiv kontroll som skal inkluderes, ikke bare av forskere som arbeider med K-562-celler, men også av de som nærmer seg ETR-basert teknologi for første gang. Som det fremgår av protokollen, anbefales kunstig nuklease (f.eks. CRISPR / Cas9)-basert genforstyrrelse som en ekstra kontroll av både effektiviteten av genlevering i celletypen av interesse og av fenotypen av celler som er fratatt målgenet. Etter den første skjermen av gRNA som skal kobles til CRISPR / dCas9-baserte ETR, hvis ingen av de testede gRNAene er i stand til å permanent dempe målgenet, bør man vurdere i følgende rekkefølge: 1) øke mengden gRNA og ETR levert; 2) testing av bassenger av de beste gRNAene på jakt etter synergistiske effekter mellom dem. Hvis langvarig silencing fortsatt ikke oppnås, bør man vurdere: 3) teste flere gRNAer, som kan målrette mot steder som er mer relevante for å instruere epigenetisk silencing; 4) bytte til ZFP8– eller TALE9-baserte DBD-plattformer, som kan ha en forbedret bindingskapasitet til målkromatinet; 5) bytte fra forbigående til stabil – for eksempel integrering av viralt vektorbasert uttrykk av ETR (enten gRNA eller dCas9-fusjonskonstruksjonene eller begge deler når man tar i bruk CRISPR / dCas9-teknologien). Siden vår gruppe utviklet, og har solid erfaring med, samlevering av de tre separate ETRene30, er protokollen og resultatene som vises her basert på denne tilnærmingen. Imidlertid kan en lignende konseptuell arbeidsflyt sannsynligvis brukes for et alt-i-ett CRISPR-basert system32.
Evaluering av ETRs off-target-aktivitet
Flere studier har vist foreløpige in vitro-indikasjoner på spesifisiteten til ETR basert på kombinasjonen av KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomenene30,31,32. Imidlertid, hvis ingen av dem blant de testede gRNAene viser en tilfredsstillende spesifisitetsprofil når det gjelder transkripsjonsregulering og / eller de novo DNA-metylering, kan man forfølge to ikke-gjensidig utelukkende strategier: a) redusere oppholdstiden til ETRene inne i cellen (og dermed deres potensielle aktivitet utenfor målet) ved enten å redusere dosene av ETR eller teste alternative leveringssystemer. For eksempel, sammenlignet med plasmider, forventes både mRNA og proteinlevering å redusere celleeksponeringstiden for ETR og følgelig sannsynligheten for aktivitet utenfor målet55; b) bytte til nyere Cas9-varianter, optimalisert for å redusere off-target-bindingen til plattform56, eller til alternative ZFP8– eller TALE9-baserte DNA-bindingsteknologier. Det er viktig å vurdere at, sammenlignet med mock-behandlede prøver, påvirkes on-target og off-target aktiviteten av geninaktivering ikke bare av bindingen av DBD til deres målsekvens, men også av den potensielle kapasiteten til de epigenetiske effektordomenene som skal rekrutteres til andre loci av deres naturlige, endogene kofaktorer. Derfor kan reduksjon av oppholdstiden for ETR i målcellen redusere ikke bare sannsynligheten for binding av DBD til off-target nettsteder, men også sannsynligheten for at ETR skal samhandle med endogene kofaktorer, med potensielle fordeler når det gjelder spesifisitet og ulemper når det gjelder målaktivitet. Til slutt, sammenlignet med mock-behandlede prøver, kan noen av de transkripsjonelle og mindre sannsynlige CpG-metyleringsendringene målt i lydløse celler ganske enkelt avledes ved berøvelse av målgenet. Disse anses ikke som utenfor målene for lyddempingsteknologien. For å identifisere dem bør man også inkludere genforstyrrelser ved kunstig nuklease i forsøkspanelet 8,9,10. Biologiske endringer på grunn av det funksjonelle tapet av målgenet vil bli delt mellom epigenetisk silencing og denne alternative teknologien.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica og Deborah Cipria for samarbeidet med å utvikle den epigenetiske silencing-teknologien gjennom årene; Dejan Lazarevic og Francesca Giannese for kritisk gjennomgang av RNA-seq og MeDIP-seq analysene beskrevet i protokollen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til A.L. fra Telethon Foundation (TIGET grant no. F1) og EU Horizon 2020 Program (UPGRADE). Illustrasjoner er laget med BioRender.com.
FORFATTERE BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. og A.C. bidro med utforming av protokollen og skriving av manuskriptet; S.V., I.M. og D.C. utformet bioinformatikkseksjonene i protokollen og reviderte manuskriptet; A.M. og A.L. utformet protokollen, unnfanget og skrev manuskriptet med innspill fra alle forfatterne.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |