Karakterisering af en patogen Escherichia coli-stamme afledt af Oreochromis spp. Gårde ved hjælp af helgenomsekventering

Summary

Gennemførligheden af helgenomsekventering (WGS) strategier ved hjælp af benchtop-instrumenter har forenklet genomforhøret af hver mikrobe af folkesundhedsrelevans i en laboratorieindstilling. En metodologisk tilpasning af arbejdsgangen for bakteriel WGS er beskrevet, og en bioinformatikrørledning til analyse præsenteres også.

Abstract

Akvakultur er en af de hurtigst voksende fødevareproducerende sektorer på verdensplan, og dyrkning af tilapia (Oreochromis spp.) er den største dyrkede ferskvandsfiskesort. Da akvakulturpraksis er modtagelig for mikrobiel kontaminering fra menneskeskabte kilder, er der behov for omfattende antibiotikabrug, hvilket fører til, at akvakultursystemer bliver en vigtig kilde til antibiotikaresistente og patogene bakterier af klinisk relevans såsom Escherichia coli (E. coli). Her blev den antimikrobielle resistens, virulens og mobilomegenskaber ved en patogen E. coli-stamme , genvundet fra indlandsopdrættet Oreochromis spp., belyst gennem helgenomsekventering (WGS) og i silicoanalyse . Antimikrobiel følsomhedstest (ASAT) og WGS blev udført. Desuden blev fylogenetisk gruppe, serotype, multilocussekvenstypning (MLST), erhvervet antimikrobiel resistens, virulens, plasmid og prophageindhold bestemt ved hjælp af forskellige tilgængelige webværktøjer. E. coli-isolatet udviste kun mellemliggende modtagelighed for ampicillin og blev karakteriseret som ONT: H21-B1-ST40-stamme ved WGS-baseret typning. Selv om der kun blev påvist et enkelt antimikrobielt resistensrelateret gen [mdf(A)], blev der identificeret flere virulensassocierede gener (VAG’er) fra den atypiske enteropatogene E. coli (aEPEC) patotype. Derudover blev lasten af plasmid replicons fra store plasmidgrupper og 18 prophage-associerede regioner detekteret. Afslutningsvis giver WGS-karakteriseringen af et aEPEC-isolat, der er genvundet fra et dambrug i Sinaloa, Mexico, indsigt i dets patogene potentiale og den mulige sundhedsrisiko for mennesker ved indtagelse af rå akvakulturprodukter. Det er nødvendigt at udnytte næste generations sekventeringsteknikker (NGS) til undersøgelse af miljømikroorganismer og at vedtage en sundhedsramme for at lære, hvordan sundhedsspørgsmål opstår.

Introduction

Akvakultur er en af de hurtigst voksende fødevareproducerende sektorer på verdensplan, og dens produktionspraksis har til formål at tilfredsstille den stigende efterspørgsel efter fødevarer til konsum. Den globale akvakulturproduktion er tredoblet fra 34 mio. tons (Mt) i 1997 til 112 mio. tons i 2017¹. De vigtigste artsgrupper, der bidrog til næsten 75% af produktionen, var tang, karper, muslinger, havkat og tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Forekomsten af sygdomme forårsaget af mikrobielle enheder er imidlertid uundgåelig på grund af intensivt fiskeopdræt, hvilket fører til potentielle økonomiske tab².

Brug af antibiotika i fiskeopdrætspraksis er velkendt for forebyggelse og behandling af bakterielle infektioner, den vigtigste begrænsende faktor i produktiviteten ^3,4. Ikke desto mindre akkumuleres resterende antibiotika i akvakultursedimenter og vand, udøver selektivt tryk og ændrer de fiskeassocierede og de bosiddende bakteriesamfund 5,6,7,8. Derfor fungerer akvakulturmiljøet som et reservoir for antimikrobielle resistensgener (ARG’er) og den yderligere fremkomst og spredning af antibiotikaresistente bakterier (ARB) i det omgivende miljø⁹. Ud over de bakterielle patogener, der almindeligvis observeres, påvirker fiskeopdrætspraksis, forekommer der ofte medlemmer af Enterobacteriaceae-familien, herunder humane patogenstammer af Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. og Salmonella spp.10. E. coli er den mest almindelige mikroorganisme isoleret fra fiskemel og vand i fiskeopdræt 11,12,13,14,15.

E. coli er en alsidig gramnegativ bakterie, der befinder sig i mave-tarmkanalen hos pattedyr og fugle som et kommensalt medlem af deres tarmmikrobiota. E. coli har imidlertid en meget adaptiv kapacitet til at kolonisere og fortsætte i forskellige miljømæssige nicher, herunder jord, sedimenter, mad og vand¹⁶. På grund af gengevinsten og -tabet gennem fænomenet horisontal genoverførsel (HGT) har E. coli hurtigt udviklet sig til et veltilpasset antibiotikaresistent patogen, der er i stand til at forårsage et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker og dyr^17,18. Baseret på isolationsoprindelsen defineres patogene varianter som intestinal patogen E. coli (InPEC) eller ekstra-intestinal patogen E. coli (ExPEC). Desuden er InPEC og ExPEC underklassificeret i veldefinerede patotyper i henhold til sygdomsmanifestation, genetisk baggrund, fænotypiske træk og virulensfaktorer (VF’er)^16,17,19.

Traditionel kultur og molekylære teknikker til patogene E. coli-stammer har muliggjort hurtig påvisning og identifikation af forskellige patotyper. De kan dog være tidskrævende, besværlige og kræver ofte høj teknisk uddannelse¹⁹. Desuden kan ingen enkelt metode bruges til pålideligt at studere alle patogene varianter af E. coli på grund af kompleksiteten af deres genetiske baggrund. I øjeblikket er disse ulemper blevet overvundet med fremkomsten af teknologier til high-throughput sekventering (HTS). Helgenomsekventering (WGS) tilgange og bioinformatiske værktøjer har forbedret udforskningen af mikrobielt DNA overkommeligt og i stor skala, hvilket letter den dybtgående karakterisering af mikrober i en enkelt kørsel, herunder nært beslægtede patogene varianter^20,21,22. Afhængigt af de biologiske spørgsmål kan flere bioinformatikværktøjer, algoritmer og databaser bruges til at udføre dataanalyse. For eksempel, hvis hovedmålet er at vurdere tilstedeværelsen af ARG’er, VF’er og plasmider, kan værktøjer som ResFinder, VirulenceFinder og PlasmidFinder sammen med deres tilknyttede databaser være et godt udgangspunkt. Carriço et ^al.22 gav et detaljeret overblik over de forskellige bioinformatiksoftware og relaterede databaser, der blev anvendt til mikrobiel WGS-analyse, fra forbehandling af rådata til fylogenetisk slutning.

Flere undersøgelser har vist WGS’s brede anvendelighed til genomforhør vedrørende antimikrobielle resistensegenskaber, patogent potentiale og sporing af fremkomsten og de evolutionære forhold mellem klinisk relevante varianter af E. coli hentet fra forskellige oprindelser^23,24,25,26 . WGS har gjort det muligt at identificere molekylære mekanismer, der ligger til grund for den fænotypiske resistens over for antimikrobielle stoffer, herunder de sjældne eller komplekse resistensmekanismer. Dette er ved at detektere erhvervede ARG-varianter, nye mutationer i lægemiddelmålsgener eller promotorregioner^27,28. Desuden tilbyder WGS potentialet til at udlede antimikrobielle resistensprofiler uden at kræve forudgående viden om resistensfænotypen for en bakteriestamme²⁹. Alternativt har WGS tilladt karakterisering af de mobile genetiske elementer (MGE’er), der bærer både antimikrobiel resistens og virulensegenskaber, hvilket har drevet bakteriegenomudviklingen af eksisterende patogener. For eksempel resulterede anvendelsen af WGS under undersøgelsen af det tyske E. coli-udbrud i 2011 i at afdække de unikke genomiske træk ved en tilsyneladende ny E. coli-patotype; interessant nok stammede disse udbrudsstammer fra den enteroaggale E. coli (EAEC) gruppe, som erhvervede prophage, der koder for Shiga-toksinet fra den enterohemorragiske E. coli (EHEC) patotype³⁰.

Dette arbejde præsenterer en metodologisk tilpasning af arbejdsgangen for bakteriel WGS ved hjælp af en benchtop sequencer. Desuden leveres en bioinformatikrørledning ved hjælp af webbaserede værktøjer til at analysere de resulterende sekvenser og yderligere støtte forskere med begrænset eller ingen bioinformatikekspertise. De beskrevne metoder tillod belysning af antimikrobiel resistens, virulens og mobilomegenskaber ved en patogen E. coli-stamme ACM5, isoleret i 2011 fra indlandsopdrættet Oreochromis spp. i Sinaloa, Mexico¹².

Protocol

BEMÆRK: E. coli-stammen ACM5 blev genvundet ved forarbejdning og dyrkning af fiskeprøven til bestemmelse af fækal coliform (FC)12. Under prøveudtagningen af fisk viste fisk ikke kliniske tegn på sygdom, bakteriel eller svampeinfektion, og der herskede en gennemsnitstemperatur på 22,3 °C. Efter isolering blev E. coli-isolatet udsat for biokemisk test og kryopræservering i hjernehjerteinfusion (BHI) bouillon med DMSO (8% v / v) som kryoprotektivt middel. <p class="jove_…

Representative Results

Den antimikrobielle modtagelighed blev bestemt ved diskdiffusionsmetoden og fortolket af CLSI-breakpointkriterier for 12 antibiotika, der spænder over seks forskellige antimikrobielle klasser, det vil sige aminoglycosider, β-lactamer, fluorquinoloner, nitrofuraner, phenicols og folatvejantagonister. E. coli ACM5 udviste følsomhed over for alle antibiotika undtagen et β-lactamlægemiddel. Fire β-lactam lægemidler blev testet: ampicillin, carbenicillin, cephalothin og cefotaxim. Blandt disse blev der målt e…

Discussion

Denne undersøgelse præsenterer en tilpasning af den bakterielle WGS-arbejdsgang ved hjælp af en benchtop sequencer og en pipeline til genomisk karakterisering af en patogen E. coli-variant. Afhængigt af den anvendte sekventeringsplatform kan behandlingstiderne (TAC’er) for våde laboratorieprocedurer (bakteriedyrkning, gDNA-ekstraktion, biblioteksforberedelse og sekventering) og sekvensanalyse variere, især hvis langsomt voksende bakterier studeres. Efter protokollen for WGS beskrevet ovenfor var TAT inden …

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)