Karakterisering av en patogen Escherichia coli-stam härledd från Oreochromis spp. Gårdar som använder helgenomsekvensering

Summary

Genomförbarheten av strategier för helgenomsekvensering (WGS) med hjälp av bänkinstrument har förenklat genomförhöret av varje mikrob av folkhälsorelevans i en laboratoriemiljö. En metodologisk anpassning av arbetsflödet för bakteriell WGS beskrivs och en bioinformatisk pipeline för analys presenteras också.

Abstract

Vattenbruk är en av de snabbast växande livsmedelsproducerande sektorerna i världen och odling av tilapia (Oreochromis spp.) utgör den största sötvattensfisksorten som odlas. Eftersom vattenbruksmetoder är mottagliga för mikrobiell kontaminering som härrör från antropogena källor behövs omfattande användning av antibiotika, vilket leder till att vattenbrukssystem blir en viktig källa till antibiotikaresistenta och patogena bakterier av klinisk relevans, såsom Escherichia coli (E. coli). Här belystes den antimikrobiella resistensen, virulensen och mobilomegenskaperna hos en patogen E. coli-stam , som återhämtats från inlandsodlad Oreochromis spp., genom helgenomsekvensering (WGS) och i silicoanalys . Antimikrobiell resistensbestämning (AST) och WGS utfördes. Dessutom bestämdes fylogenetisk grupp, serotyp, multilocus sequence typing (MLST), förvärvad antimikrobiell resistens, virulens, plasmid och prophageinnehåll med hjälp av olika tillgängliga webbverktyg. E. coli-isolatet uppvisade endast mellanliggande mottaglighet för ampicillin och karakteriserades som ONT: H21-B1-ST40-stam genom WGS-baserad typning . Även om endast en enda antimikrobiell resistensrelaterad gen detekterades [mdf(A)], identifierades flera virulensassocierade gener (VAG) från den atypiska enteropatogena E. coli (aEPEC) patotypen. Dessutom detekterades lasten av plasmidrepliker från stora plasmidgrupper och 18 prophage-associerade regioner. Sammanfattningsvis möjliggör WGS-karakteriseringen av ett aEPEC-isolat, återhämtat från en fiskodling i Sinaloa, Mexiko, insikter om dess patogena potential och den möjliga risken för människors hälsa att konsumera råa vattenbruksprodukter. Det är nödvändigt att utnyttja nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) för att studera miljömikroorganismer och att anta en hälsoram för att lära sig hur hälsoproblem uppstår.

Introduction

Vattenbruk är en av de snabbast växande livsmedelsproducerande sektorerna i världen, och dess produktionsmetoder är avsedda att tillgodose den ökande efterfrågan på livsmedel för mänsklig konsumtion. Den globala vattenbruksproduktionen har tredubblats från 34 miljoner ton (Mt) 1997 till 112 miljoner ton 2017¹. De viktigaste artgrupperna, som bidrog till nästan 75% av produktionen, var tång, karpar, musslor, havskatt och tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Uppkomsten av sjukdomar som orsakas av mikrobiella enheter är dock oundviklig på grund av intensiv fiskodling, vilket leder till potentiella ekonomiska förluster².

Antibiotikaanvändning i fiskodlingsmetoder är välkänd för att förebygga och behandla bakterieinfektioner, den viktigaste begränsande faktorn i produktivitet ^3,4. Icke desto mindre ackumuleras kvarvarande antibiotika i vattenbrukssediment och vatten, utövar selektivt tryck och modifierar de fiskassocierade och de bosatta bakteriesamhällena 5,6,7,8. Följaktligen fungerar vattenbruksmiljön som en reservoar för gener för antimikrobiell resistens (ARG) och ytterligare uppkomst och spridning av antibiotikaresistenta bakterier (ARB) i den omgivande miljön⁹. Förutom de bakteriella patogener som vanligtvis observeras som påverkar fiskodlingsmetoder påträffas ofta medlemmar av familjen Enterobacteriaceae, inklusive mänskliga patogenstammar av Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., och Salmonella spp.10. E. coli är den vanligaste mikroorganismen isolerad från fiskmjöl och vatten i fiskodling 11,12,13,14,15.

E. coli är en mångsidig gramnegativ bakterie som bor i mag-tarmkanalen hos däggdjur och fåglar som en kommensal medlem av deras tarmmikrobiota. E. coli har dock en mycket anpassningsförmåga att kolonisera och kvarstå i olika miljönischer, inklusive jord, sediment, mat och vatten¹⁶. På grund av genförstärkningen och förlusten genom det horisontella genöverföringsfenomenet (HGT) har E. coli snabbt utvecklats till en väl anpassad antibiotikaresistent patogen som kan orsaka ett brett spektrum av sjukdomar hos människor och djur^17,18. Baserat på isoleringens ursprung definieras patogena varianter som tarmpatogena E. coli (InPEC) eller extra-intestinala patogena E. coli (ExPEC). Dessutom är InPEC och ExPEC indelade i väldefinierade patotyper beroende på sjukdomsmanifestation, genetisk bakgrund, fenotypiska egenskaper och virulensfaktorer (VF)^16,17,19.

Traditionell odling och molekylära tekniker för patogena E. coli-stammar har möjliggjort snabb upptäckt och identifiering av olika patotyper. De kan dock vara tidskrävande, mödosamma och kräver ofta hög teknisk utbildning¹⁹. Dessutom kan ingen enskild metod användas för att på ett tillförlitligt sätt studera alla patogena varianter av E. coli på grund av komplexiteten i deras genetiska bakgrund. För närvarande har dessa nackdelar övervunnits med tillkomsten av HTS-teknik (high-throughput sequencing). Helgenomsekvensering (WGS) och bioinformatiska verktyg har förbättrat utforskningen av mikrobiellt DNA överkomligt och i stor skala, vilket underlättar den djupgående karakteriseringen av mikrober i en enda körning, inklusive närbesläktade patogena varianter^20,21,22. Beroende på de biologiska frågorna kan flera bioinformatiska verktyg, algoritmer och databaser användas för att utföra dataanalys. Till exempel, om huvudmålet är att bedöma förekomsten av ARGs, VFs och plasmider, kan verktyg som ResFinder, VirulenceFinder och PlasmidFinder, tillsammans med deras tillhörande databaser, vara en bra utgångspunkt. Carriço et ^al.22 gav en detaljerad översikt över de olika bioinformatikprogrammen och relaterade databaser som används för mikrobiell WGS-analys, från förbehandling av rådata till fylogenetisk inferens.

Flera studier har visat den breda nyttan av WGS för genomförhör angående antimikrobiella resistensattribut, patogen potential och spårning av framväxten och evolutionära relationer mellan kliniskt relevanta varianter av E. coli som kommer från olika ursprung^23,24,25,26 . WGS har gjort det möjligt att identifiera molekylära mekanismer som ligger till grund för den fenotypiska resistensen mot antimikrobiella medel, inklusive de sällsynta eller komplexa resistensmekanismerna. Detta genom att detektera förvärvade ARG-varianter, nya mutationer i läkemedelsmålgener eller promotorregioner^27,28. Dessutom erbjuder WGS potential att härleda antimikrobiella resistensprofiler utan att kräva förkunskaper om resistensfenotypen hos en bakteriestam²⁹. Alternativt har WGS tillåtit karakterisering av de mobila genetiska elementen (MGE) som bär både antimikrobiell resistens och virulensegenskaper, vilket har drivit bakteriegenomutvecklingen av befintliga patogener. Till exempel resulterade tillämpningen av WGS under undersökningen av det tyska E. coli-utbrottet 2011 i att avslöja de unika genomiska egenskaperna hos en till synes ny E. coli-patotyp; Intressant nog härstammar dessa utbrottsstammar från den enteroaggregerande E. coli (EAEC) -gruppen, som förvärvade prophaget som kodar för Shiga-toxinet från den enterohemorragiska E. coli (EHEC) patotypen³⁰.

Detta arbete presenterar en metodologisk anpassning av arbetsflödet för bakteriell WGS med hjälp av en bänksekvenserare. Dessutom tillhandahålls en bioinformatikpipeline med hjälp av webbaserade verktyg för att analysera de resulterande sekvenserna och ytterligare stödja forskare med begränsad eller ingen bioinformatisk expertis. De beskrivna metoderna gjorde det möjligt att belysa antimikrobiell resistens, virulens och mobilomegenskaper hos en patogen E. coli-stam ACM5, isolerad 2011 från inlandsbrukad Oreochromis spp.

Protocol

OBS: E. coli-stammen ACM5 återvanns genom bearbetning och odling av fiskprovet för fekal koliform (FC) bestämning12. Under fiskprovtagningen visade fisken inga kliniska tecken på sjukdom, bakteriell eller svampinfektion, och en medeltemperatur på 22,3 °C rådde. Efter isolering utsattes E . coli-isolatet för biokemisk testning och kryokonserverades i hjärnhjärtinfusionsbuljong (BHI) med DMSO (8% v / v) som kryoskyddande medel. 1. Återak…

Representative Results

Den antimikrobiella mottagligheten bestämdes av diskdiffusionsmetoden och tolkades av CLSI-brytpunktskriterier för 12 antibiotika som spänner över sex distinkta antimikrobiella klasser, det vill säga aminoglykosider, β-laktamer, fluorokinoloner, nitrofuraner, fenikol och folatvägsantagonister. E. coli ACM5 uppvisade känslighet för alla antibiotika utom ett β-laktamläkemedel. Fyra β-laktamläkemedel testades: ampicillin, karbenicillin, cefalothin och cefotaxim. Bland dessa mättes en 14 mm hämningsha…

Discussion

Denna studie presenterar en anpassning av det bakteriella WGS-arbetsflödet med hjälp av en bänksekvenserare och en pipeline för genomisk karakterisering av en patogen E. coli-variant. Beroende på vilken sekvenseringsplattform som används kan handläggningstiderna (TATs) för våta laboratorieprocedurer (bakterieodling, gDNA-extraktion, biblioteksberedning och sekvensering) och sekvensanalys variera, särskilt om långsamt växande bakterier studeras. Efter protokollet för WGS som beskrivs ovan var TAT ino…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)