Способность бактериофага перемещать ДНК между бактериальными клетками делает их эффективными инструментами для генетических манипуляций с их бактериальными хозяевами. Здесь представлена методология индуцирования, восстановления и использования φBB-1, бактериофага Borrelia burgdorferi, для трансдукции гетерологичной ДНК между различными штаммами спирохеты болезни Лайма.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фаго-опосредованная генетическая манипуляция болезнью Лайма Spirochete Borrelia burgdorferi
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Введение чужеродной ДНК в спирохету Borrelia burgdorferi было почти исключительно осуществлено путем трансформации с использованием электропорации. Этот процесс имеет заметно более низкую эффективность спирохеты болезни Лайма по сравнению с другими, лучше охарактеризованными грамотрицательными бактериями. Скорость успеха трансформации в значительной степени зависит от наличия концентрированных количеств высококачественной ДНК из определенных фонов и подвержена значительной изменчивости от штамма к штамму. Альтернативные средства для введения чужеродной ДНК (т.е. челночных векторов, флуоресцентных репортеров и маркеров устойчивости к антибиотикам) в B. burgdorferi могут стать важным дополнением к арсеналу полезных инструментов для генетической манипуляции спирохетой болезни Лайма. Бактериофаги были хорошо известны как естественные механизмы движения ДНК среди бактерий в процессе, называемом трансдукцией. В этом исследовании был разработан метод использования вездесущего боррелиального фага φBB-1 для трансдукции ДНК между клетками B. burgdorferi как одного, так и разного генетического происхождения. Трансдуцированная ДНК включает в себя как боррелиальную ДНК, так и гетерологичную ДНК в виде небольших челночных векторов. Эта демонстрация предполагает потенциальное использование фаговой трансдукции в качестве дополнения к электропорации для генетических манипуляций со спирохетой болезни Лайма. В настоящем отчете описываются методы индукции и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, использование этого фага в анализах трансдукции, а также отбор и скрининг потенциальных трансдуктантов.
Введение
Разработка инструментов для генетической манипуляции спирохетальной бактерией Borrelia burgdorferi добавила неизмеримую ценность пониманию природы болезни Лайма 1,2,3,4. B. burgdorferi имеет необычно сложный геном, состоящий из небольшой линейной хромосомы и как линейных, так и круговых плазмид 5,6. Спонтанная потеря плазмид, внутригенная перестройка (перемещение генов из одной плазмиды в другую в пределах одного организма) и горизонтальный перенос генов (HGT, движе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с использованием рекомбинантной ДНК и организмов BSL-2 были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Куиннипиак.
1. Подготовка культуры Б. бургдорфери для получения φBB-1
- Приготовить среду Барбура-Стеннера-Келли с добавлением 6,6% инактивированной теплом нормальной кроличьей сыворотки (BSK)15. Для 1 л 1x BSK смешайте компоненты, перечисленные в таблице 1 , в 900 мл воды, отрегулируйте рН до 7,6, используя 1 N гидроксида натрия, и медленно перемешайте при 4 °C в течение 2-4 ч. После завершения перемешивания ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование бактериофага для перемещения ДНК между более легко трансформируемыми штаммами B. burgdorferi или клонами, которые непокорны электротрансформации, представляет собой еще один инструмент для продолжения молекулярного исследования детерминант болезни Лайма. Трансдукционный анализ, описанный в настоящем описании, может быть модифицирован по мере необходимости для облегчения перемещения ДНК между любыми интересующими клонами с использованием одного или двух антибиотиков для отбора потенциальных трансдук.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Использование трансдукции может представлять собой один из методов преодоления, по меньшей мере, некоторых биологических и технических барьеров, связанных с электротрансформацией B. burgdorferi 1,4,13,37. Во многих системах бактериофаг может перемещать ДНК хозяина (непрофага) между бактериальными клетками путем генерализованной или специализированной трансдукции 22,23,24,49,50.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автору нечего раскрывать.
Благодарности
Автор хотел бы поблагодарить Шону Рид, Д. Скотта Сэмюэлса и Патрика Секора за их полезную дискуссию и Вареона (Пэм) Чонвиравонга за их техническую помощь. Эта работа была поддержана Департаментом биомедицинских наук и исследовательскими грантами факультета Кристиану Х. Эггерсу из Школы наук о здоровье в Университете Куиннипиак.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фильтрующие установки объемом 1 л (PES, 0,22 &; m размер пор) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| пробирка 12 мм x 75 мм (двухпозиционная крышка) (полипропилен) | США Scientific | 1450-0810 | вмещает 4 мл с малым объемом пустот (для индукции) |
| 15 мл конические центрифужные пробирки (полипропилен) | США Scientific | 5618-8271 | |
| 1-метил-3-нитрозо-нитрогуанидин (MNNG) | Millipore Sigma | ВНИМАНИЕ: потенциальный канцероген; больше не доступен, не тестировал предложенный заменитель | |
| 5,75-дюймовые пипетки Пастера (с ватной пробкой/боросиликатным стеклом/нестерильные) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | автоклав перед использованием |
| конических центрифужных пробирок объемом 50 мл (полипропилен) | США Scientific | 1500-1211 | |
| Абсолютный этанол | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Бычий сывороточный альбумин (класс замены сыворотки) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Хлороформ (для молекулярной биологии) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | ВНИМАНИЕ: летучий органический; использовать только в химическом вытяжном шкафу |
| CMRL-1066 без L-глютамина (порошок) | US Biological | C5900-01 | сорт клеточной культуры |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Раствор реагента гентамицина | Gibco | 15750-060 | |
| Глюкоза (декстроза безводная) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Канамицина сульфат | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 &; | Миллипор Sigma | SLGSM33SS | для фильтрации стерилизующих антибиотиков и других небольших объемов растворов |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | ВНИМАНИЕ: потенциальный канцероген; использование только в химическом вытяжном шкафу |
| N-ацетил-D-глюкозамин | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Олигонуклеотиды (праймеры для ПЦР) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (набор для экстракции полного генома) | G Biosciences | 786-136 | |
| Чашка Петри (100 мм &раз; 15 мм) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Счетная камера Петрофф-Хауссер | Hausser Scientific | HS-3900 | |
| Крышка счетной камеры Петрофф-Хауссер | научный Hausser | HS-5051 | |
| Полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Сыворотка кролика нестерильная следовая гемолизированная молодняк (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | термоинактивация в соответствии с инструкциями производителя |
| Полумикро УФ прозрачные кюветы | США Scientific | 9750-9150 | |
| Бикарбонат натрия | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Хлорид | натрияThermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| пируват натрия | Millipore | Sigma P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| раствор сульфата стрептомицина | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Дигидрат цитрата тринатрия | Millipore Sigma | S1804-500G Цитрат | натрия для BSK |
Ссылки
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
