Summary
Dette papir beskriver en ny musemodel for overgangen af pneumokokker fra en asymptomatisk kolonisator til et sygdomsfremkaldende patogen under virusinfektion. Denne model kan let tilpasses til at studere polymikrobielle og værtspatogeninteraktioner i de forskellige faser af sygdomsprogression og på tværs af forskellige værter.
Abstract
Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) er en asymptomatisk kolonisator af nasopharynx hos de fleste individer, men kan udvikle sig til et lunge- og systemisk patogen ved influenza A-virus (IAV) infektion. Fremskreden alder øger værtens modtagelighed for sekundær pneumokokpneumoni og er forbundet med forværrede sygdomsresultater. Værtsfaktorerne, der driver disse processer, er ikke veldefinerede, dels på grund af mangel på dyremodeller, der reproducerer overgangen fra asymptomatisk kolonisering til alvorlig klinisk sygdom.
Dette papir beskriver en ny musemodel, der genskaber overgangen af pneumokokker fra asymptomatisk transport til sygdom ved virusinfektion. I denne model podes mus først intranasalt med biofilmdyrkede pneumokokker for at etablere asymptomatisk vogn efterfulgt af IAV-infektion i både nasopharynx og lunger. Dette resulterer i bakteriel spredning til lungerne, lungebetændelse og tydelige tegn på sygdom, der kan udvikle sig til dødelighed. Graden af sygdom afhænger af bakteriestammen og værtsfaktorerne.
Det er vigtigt, at denne model reproducerer modtageligheden for aldring, fordi gamle mus sammenlignet med unge mus viser mere alvorlig klinisk sygdom og bukker under for sygdom oftere. Ved at adskille transport og sygdom i forskellige trin og give mulighed for at analysere de genetiske varianter af både patogenet og værten, tillader denne S. pneumoniae / IAV co-infektionsmodel detaljeret undersøgelse af interaktionerne mellem en vigtig pathobiont og værten i forskellige faser af sygdomsprogression. Denne model kan også tjene som et vigtigt redskab til at identificere potentielle terapeutiske mål mod sekundær pneumokokpneumoni hos modtagelige værter.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) er grampositive bakterier, der asymptomatisk befinder sig i nasopharynx hos de fleste raske individer 1,2. Fremme af faktorer, der ikke er fuldstændigt defineret, kan pneumokokker overgå fra godartede kolonisatorer af nasopharynx til patogener, der spredes til andre organer, hvilket resulterer i alvorlige infektioner, herunder otitis media, lungebetændelse og bakteriæmi3. Præsentationen af pneumokoksygdom afhænger til dels af stammespecifikke forskelle, herunder serotypen, som er baseret på sammensætningen af kapselpolysaccharider. Der har været over 100 serotyper karakteriseret indtil videre, og nogle er forbundet med mere invasive infektioner 4,5. Flere andre faktorer øger risikoen for pneumokoksygdom. En sådan faktor er virusinfektion, hvor risikoen for pneumokokpneumoni øges 100 gange med IAV 6,7. Historisk set er S. pneumoniae en af de mest almindelige årsager til sekundær bakteriel lungebetændelse efter influenza og er forbundet med dårligere resultater8. En anden stor risikofaktor er fremskreden alder. Faktisk er S. pneumoniae den førende årsag til samfundserhvervet bakteriel lungebetændelse hos ældre personer over 65 år 9,10. Ældre personer tegner sig for størstedelen (>75%) af dødsfald på grund af lungebetændelse og influenza, hvilket indikerer, at de to risikofaktorer - aldring og IAV-infektion - synergistisk forværrer sygdomsmodtageligheden11,12,13,14. Imidlertid forbliver de mekanismer, hvormed virusinfektion beder om overgangen af pneumokokker fra asymptomatisk kolonisator til invasiv patogen, og hvordan dette formes af værtsfaktorer, dårligt defineret. Dette skyldes i høj grad fraværet af en lille dyremodel, der rekapitulerer overgangen fra asymptomatisk pneumokokkolonisering til kritisk klinisk sygdom.
Co-infektionsstudier er klassisk blevet modelleret i mus podet med pneumokokker direkte i lungerne 7 dage efter influenzainfektion15,16. Dette reproducerer modtageligheden for sekundær bakteriel lungebetændelse og er ideel til at studere, hvordan antivirale immunresponser forringer antibakterielle forsvar17. Imidlertid har longitudinelle undersøgelser hos mennesker vist, at pneumokoktransport i nasopharynx, hvor bakterierne kan danne asymptomatiske biofilm18, er ensartet forbundet med invasive sygdomme19,20. Bakterieisolater fra infektioner i mellemøret, lungen og blodet er genetisk identiske med dem, der findes i nasopharynx20. For at studere overgangen fra asymptomatisk transport til invasiv sygdom efter IAV-infektion blev der således etableret en model, hvor mus blev intranasalt administreret biofilmdyrket pneumokokker efterfulgt af IAV-infektion i nasopharynx21,22. Virusinfektion i de øvre luftveje førte til ændringer i værtsmiljøet, der førte til spredning af pneumokokker fra biofilm og deres spredning til de nedre luftveje21. Disse dispergerede bakterier havde opreguleret ekspression af virulensfaktorer, der var vigtige for infektion, og konverterede dem fra kolonisatorer til patogener21. Disse observationer fremhæver det komplekse samspil mellem virussen, værten og bakterierne og viser, at ændringerne i værten udløst af virusinfektion har en direkte indvirkning på pneumokokadfærden, hvilket igen ændrer forløbet af bakteriel infektion. Denne model undlader imidlertid at rekapitulere de alvorlige tegn på sygdom, der observeres hos mennesker, sandsynligvis fordi virussen er begrænset til næsehulen, og de systemiske virkninger af virusinfektion på værtsimmunitet og lungeskade ikke rekapituleres.
Vi har for nylig etableret en model, der inkorporerer det komplekse samspil mellem værten og patogenerne, men også i højere grad efterligner sygdommens sværhedsgrad observeret hos mennesker23. I denne model inficeres mus først intranasalt med biofilmdyrkede pneumokokker for at etablere asymptomatisk vogn efterfulgt af IAV-infektion i både nasopharynx og lunger. Dette resulterede i bakteriel spredning til lungerne, lungebetændelse og sygdom, der udviklede sig til dødelighed hos en brøkdel af unge mus23. Denne tidligere undersøgelse viste, at både viral og bakteriel infektion ændrede værtsforsvaret: viral infektion fremmede bakteriel spredning, og tidligere bakteriel kolonisering forringede værtens evne til at kontrollere pulmonale IAV-niveauer23. Undersøgelse af immunresponset afslørede, at IAV-infektion mindskede neutrofilers antibakterielle aktivitet, mens bakteriel kolonisering sløvede type I-interferonresponset, der var kritisk for antiviralt forsvar23. Det er vigtigt, at denne model gengav modtageligheden for aldring. Sammenlignet med unge mus viste gamle mus tegn på sygdom tidligere, viste mere alvorlig klinisk sygdom og bukkede oftere under for infektion23. Arbejdet præsenteret i dette manuskript viser, at sygdomsgraden også er afhængig af bakteriestammen, fordi invasive pneumokokstammer viser mere effektiv spredning ved IAV-infektion, viser mere åbenlyse tegn på lungebetændelse og resulterer i accelererede sygdomsfrekvenser sammenlignet med ikke-invasive stammer. Således tillader denne S. pneumoniae / IAV co-infektionsmodel detaljeret undersøgelse af både patogen- og værtsfaktorer og er velegnet til at studere immunresponser på polymikrobielle infektioner i de forskellige faser af sygdomsprogression.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr. Alle procedurer blev godkendt af University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Fremstilling af kemisk definerede medier (CDM)
- Lagrene forberedes på følgende måde:
- De i tabel 1 anførte blandingsforbindelser opløses i 100 ml ultrarent vand under omrøring. Opbevares i 200 μL alikvoter ved -20 °C.
- Blanding II-forbindelserne, der er anført i tabel 1, opløses i 20 ml 0,1 M NaOH under omrøring. Opbevares i 100 μL alikvoter ved -20 °C.
- Blanding III-forbindelserne, der er anført i tabel 1, opløses i 1 ml ultrarent vand under omrøring. Opbevares i 10 μL delprøver ved 4 °C.
- Blandingen IV-forbindelsen, der er anført i tabel 1, opløses i 1 ml ultrarent vand under omrøring. Opbevares i 10 μL alikvoter ved -20 °C.
- Opløs først forbindelserne anført i tabel 2 i 15 ml ultrarent vand under omrøring. Juster pH til 7,0 med et par dråber 0,1 M NaOH og juster det endelige volumen til 20 ml ved hjælp af ultrarent vand. Opbevares i 1 ml alikvoter ved -20 °C.
- De i tabel 3 anførte forbindelser opløses i 90 ml ultrarent vand på en varmeplade ved 50 °C under omrøring. Juster pH til 7,0 med 0,1 M NaOH, og juster derefter det endelige volumen til 100 ml ved hjælp af ultrarent vand. Opbevares i 5 ml alikvoter ved -20 °C.
- Lav startfonden frisk hver gang ved at opløse forbindelserne i tabel 4 i 70 ml ultrarent vand under omrøring.
- Til den friske startbestand tilsættes følgende blandingslagre i rækkefølge: 200 μL Mix I-lager (tabel 1), 80 μL Mix II-lager (tabel 1), 10 μL Mix III-lager (tabel 1), 10 μL Mix IV-lager (tabel 2), 1 ml vitaminfond (tabel 3) og 5 ml aminosyrestamme (tabel 4).
- Når lagrene er tilsat, justeres det endelige volumen til 100 ml ved at tilsætte 30 ml ultrarent vand til bægerglasset.
- Suppler CDM med forbindelser fra tabel 4. Efter grundig blanding filtreres og opbevares ved 4 °C i højst 2 uger.
2. Dyrkning af S. pneumoniae biofilm
- Forbered RP-10-substrat ved at blande 445 ml RPMI 1640 med 50 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 5 ml penicillin/streptomycin ved henholdsvis 10.000 E/ml og 10.000 μg/ml.
- Vok NCI-H292 (H292) mucoepidermoid carcinom cellelinje. Tilsæt cellerne fra et købt hætteglas til 5 ml RP-10-medium i en T-25-vævskulturbehandlet kolbe. Der inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 3-5 dage for at nå 100 % sammenløb.
- Kontroller cellerne under et lysmikroskop ved hjælp af 10x forstørrelse for at vurdere sammenløbet.
BEMÆRK: Når alle cellerne er i kontakt med andre celler, og der ikke er nogen mellemrum imellem, nås den ønskede 100% sammenløb. - Vask cellerne 2x i 5 ml stuetemperatur PBS. Sørg for, at bufferen er calciumfri for at undgå chelatering af EDTA i følgende trin.
- Der tilsættes 1 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 5-10 minutter, indtil cellerne løsner sig. Neutralisere med 4 ml RP-10 medium. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned og overfør til et 50 ml konisk rør.
- Der tilsættes 500 μL af cellesuspensionen pr. hul til en vævskulturbehandlet plade med 24 huller. Fra en sammenflydende T-25-kolbe kan du forvente 2 × 10 6-4 × 106 celler / ml.
- Den følgende dag skal du kontrollere cellerne under et lysmikroskop for at sikre, at de er sammenflydende, som i trin 2.3. Hvis de ikke er det, skal du inkubere længere.
- Når H292-cellerne er 100% sammenflydende i 24-brøndpladen, vaskes cellerne forsigtigt 3x med 1 ml PBS ved stuetemperatur for at sikre, at der ikke er noget medium indeholdende antibiotika eller snavs tilbage.
- Efter vask af cellerne tilsættes 250 μL / hul 4% paraformaldehyd for at fiksere cellerne. Der inkuberes enten 1 time på is eller natten over ved 4 °C.
- Natten før cellefiksering skal du stribe S. pneumoniae-stammen af interesse på blodagarplader og inkubere natten over ved 37 ° C / 5% CO2.
BEMÆRK: De data, der præsenteres her, er med følgende S. pneumoniae-stammer opnået via samarbejdsudveksling: serotype 19F otitis media-isolat EF3030 24, klassisk serotype 2 Avery-stamme D3925 og serotype 4-bakteriæmiisolatTIGR4 26. Stammerne er også tilgængelige fra offentlige samlinger, der henvises til i materialetabellen. - Forbered CDM plus oxyrase (0,15 E / ml) ved at tilføje 100 μL oxyrase (30 E / ml) til 20 ml CDM.
BEMÆRK: Oxyrase bruges til at fjerne ilt for at muliggøre effektiv vækst af S. pneumoniae i flydende kultur27. - Pod bakterierne fra pladen i frisk CDM + oxyrase ved at vaske bakterierne af pladen ved at tilsætte 1 ml CDM + oxyrase og forsigtigt løfte bakteriekolonierne ved hjælp af siden af en 1 ml pipettespids, pas på ikke at skrabe agaren. Alternativt kan du bruge en podningssløjfe til at løfte bakterierne og inokulere dem i et rør indeholdende 1 ml CDM + oxyrase.
- Fortynd bakterierne i CDM + oxyrase til en start-OD600 på 0,05.
- Dyrk bakterierne i et løst lukket 50 ml konisk rør, der står ved 37 ° C / 5% CO 2, indtil en OD600 på 0,2 er nået (dette vil tage alt mellem2-5 timer). Kontroller OD600 hver time for at sikre, at OD ikke overstiger 0,2.
- Når OD har nået 0,2, hvirvel bakteriekulturrøret. Frø 0,5 ml af bakterierne på de faste H292-celler og tilsæt yderligere 0,5 ml CDM + oxyrase-medium pr. Brønd. Tilsæt 1 ml CDM + oxyrase til kontrolhullerne uden bakterier. Pladen inkuberes i 48 timer ved 34 °C/5% CO2.
BEMÆRK: Vækst ved 34 °C bruges til bedre at efterligne den lavere temperatur i nasopharynx21. - Hver 12. time efter den første såning fjernes forsigtigt 0,5 ml af mediet og genopfyldes med 0,5 ml frisk CDM + oxyrase. Pas på ikke at forstyrre den dannende biofilm. Kontroller bunden af pladen for biofilm og se efter stigende uklarhed som tiden går på grund af biofilmens vækst. For at kontrollere for forurening skal du kontrollere brøndene uden bakterier for at sikre, at kontrolbrøndene forbliver klare.
- 48 timer efter podningen fjernes supernatanten, og 2x vaskes meget forsigtigt med 1 ml PBS. Resuspender i 1 ml frisk CDM og pipetter kraftigt op og ned for at løfte biofilmen. For hver bakteriestamme samles bakterierne fra alle brøndene i et 50 ml konisk rør. Bland godt ved forsigtigt at vippe det tæt lukkede rør op og ned flere gange.
- Til det 50 ml koniske rør tilsættes 40% glycerol i CDM i lige store mængder for at opnå en bakteriel suspension med en slutkoncentration på 20% glycerol. Alikvote 1 ml i mikrocentrifugeglas, lynfryses på tøris og spares ved -80 °C.
- Før brug optælles bakterierne ved at tø en prøve op på is, dreje røret ved 1.700 × g i 5 minutter, fjerne supernatanten, resuspendere pellet i 1 ml PBS og plettere serielle fortyndinger på blodagarplader28.
- Agarpladerne dyrkes natten over ved 37 °C/5% CO2 og kolonierne tælles ved relevante fortyndinger for at opnå bakteriekoncentrationen i kolonidannende enheder (CFU)/ml.
BEMÆRK: Det anbefales at tælle bakterierne i lagrene mindst et døgn efter frysning eller senere, da der er et fald i bakteriel levedygtighed inden for de første 24 timer. De opbevarede frosne delprøver kan anvendes til efterfølgende infektion af mus i maksimalt 2 måneder.
3. Intranasal podning af mus med biofilmdyrket S. pneumoniae
- Køb mus og brug i den ønskede alder.
BEMÆRK: Mus i alderen 3-4 måneder foretrækkes frem for at modellere unge værter, og mus i alderen 21-24 måneder kan bruges til at modellere ældre personer >65 år29 år. De data, der præsenteres her, er med C57BL/6 hanmus. - De biofilmdyrkede bakterielle alikvoter tøs op på is og centrifugeres ved 1.700 × g i 5 min. Supernatanten fjernes forsigtigt og kasseres uden at forstyrre pelletten, bakterierne vaskes ved at resuspendere pelletten i 1 ml PBS og centrifugeres igen ved 1.700 × g i 5 min. Supernatanten fjernes, og pelletpen resuspenderes i den mængde, der er nødvendig for at nå den ønskede koncentration (der sigtes mod 5 ×10 6 CFU/10 μl til intranasal podning). Bekræft mængden af bakterier, der administreres ved at plettere det forberedte inokulum på blodagarplader som i trin 2.19.
- Musene podes intranasalt med 5 × 106 CFU ved at pipettere 5 μL af det fortyndede podemateriale i hver naris. Sørg for at holde musene fast og stabilisere hovedet, indtil lydstyrken er indåndet (typisk inden for få sekunder efter pipettering af lydstyrken i narerne). Udfør dette trin i fravær af anæstesi for at forhindre lungeaspiration af inokulumet.
4. Viral infektion med influenza A-virus (IAV)
- Ved 48 timer efter intranasal podning med S. pneumoniae, optø IAV stammen af interesse på is.
BEMÆRK: De data, der præsenteres her, er med en musetilpasset stamme af influenza A-virus A/PR/8/34 H1N1, der blev opnået via samarbejdsudveksling30. - Når virussen er optøet, fortyndes virussen i PBS til den ønskede koncentration; sigte mod 20 plakdannende enheder (PFU) / 50 μL til intratrakeal infektion og 200 PFU / 10 μL til intranasal infektion. For mock-inficerede og bakterie-only grupper, brug PBS til at inokulere musene.
- Placer oftalmisk smøremiddel på musenes øjne før anæstesi. Bedøv musene med 5% isofluran og bekræft anæstesi med en fast tåklemme.
- Når dyret er bedøvet, fjernes det fra isoflurankammeret og straks inficeres de bedøvede mus med 50 μL (20 PFU) IAV intratrachealt ved hjælp af stump pincet til at trække tungen ud af munden og pipettere væskemængden ned i luftrøret.
- Placer musene i et separat bur og overvåg indtil fuldstændig opsving (de er i stand til at opretholde brystliggende [i stand til at ligge oprejst på brystet]).
- Efter restitution podes musene straks intranasalt med 10 μL (200 PFU) IAV ved hjælp af podningsmetoden i trin 3.3.
- Husmus, der har gennemgået en eller dobbelt bakteriel og viral infektion med samme infektionsgruppe og adskiller dem fra de andre grupper.
5. Overvågning af musene for sygdomssymptomer
- Overvåg musene dagligt i mindst 10 dage og scor blindt for tegn på sygdom som følger:
- Score som følger for vægttab: 0 = 5% eller mindre; 1 = 5% -10%; 2 = 10% -15%; 3 = 20% eller mere. Aflive musene ved hjælp af CO2 -indånding, når vægttabsscoren er på 3.
- Score som følger for aktivitet: 0 = normal/aktiv; 1 = bevægende, men lidt formindsket; 2 = formindsket; 3 = stærkt formindsket/sløv (bevæger sig kun ved berøring), 4 = koma/immobil. Aflive musene, når aktivitetsscoren er på 3.
- Score som følger for kropsholdning: 0 = ingen fornemmelse (normal); 1 = let bøjet kropsholdning; 2 = alvorlig fornemmelse. Aflive musene, når kropsholdningsscoren er på 2.
- Score som følger for øjnene: 0 = normal; 1 = fremspringende; 1 = nedsænket; 1 = lukket; 1 = udledning. Det kan være en kombination. Tilføj totalerne for den endelige øjenscore.
- Score som følger for vejrtrækning: 0 = Normal vejrtrækning; 1 = uregelmæssig eller ændret (højere/lavere sats) 2 = anstrengt (overdreven indsats eller gispende). Afliv musene, når vejrtrækningsscoren er på 2.
- Baseret på ovenstående kriterier tilføjes de individuelle scorer for en samlet klinisk score på sund (0) til ekstremt syg (15). Betragt enhver mus, der viser en samlet score over 2, som syg. Aflive alle mus humant, der viser en samlet score over 9 eller de angivne scorer for hvert kriterium, og markér dem på overlevelseskurven.
6. Behandling af inficeret væv til bakteriel tælling
- 48 timer efter IAV-infektion aflives musene.
- Placer musen i liggende stilling. Brug 70% ethanol til at sprøjte musens bryst og mave for at rense pelsen. Brug tang til at klemme pelsen og huden midt på musen og klip pelsen med 4,5 i dissektionssaks for at udsætte området fra leveren op til brystet.
- Blodindsamling
- Brug dissektionssaks til forsigtigt at skære ind i bughulen for at udsætte leveren. Brug tang til at udsætte leverportalvenen øverst i leveren nær membranen. Klip leverportalvenen ved hjælp af dissektionsaksen. Når blodet begynder at samle sig i bughulen, opsamles 10 μL blod ved hjælp af en mikropipette og anbringes i 90 μL antikoagulationsopløsning (50 mM EDTA-opløsning i PBS) i et mikrocentrifugerør til plettering for bakteriel byrde.
- Brug en P-1000 mikropipette til at opsamle resten af blodet, læg det i et blodopsamlingsrør og centrifuger ved 7.600 × g i 2 minutter for at opsamle serumet. Gem sera i mikrocentrifugeglas ved -80 °C til efterfølgende analyse af ethvert ønsket cytokin eller metabolit.
- Lunge indsamling
- Brug dissektionssaks til at skære siderne af det blottede brystkasse op og træk forsigtigt ribbenene op mod musens hoved for at udsætte hjertet. Indsæt en 25 G kanyle fastgjort til en 10 ml sprøjte fyldt med PBS i højre ventrikel og begynd langsomt perfusing. Se efter blegning af lungerne som en indikator for vellykket perfusion. Skyl langsomt for at undgå at bryde lungevævet.
- Løft hjertet med tangen og lav et snit for at adskille lungerne og hjertet. Når de er adskilt, skal du samle alle lungens lapper op med tangen og skylle i en skål med steril PBS for at fjerne eventuelt resterende blod. I en petriskål hakkes lungerne i små stykker og blandes godt. Fjern halvdelen af lungeblandingen til bestemmelse af bakteriel CFU eller viral PFU og læg den i et rundt bund 15 ml rør fyldt med 0,5 ml PBS til homogenisering.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at tage forskellige lapper af samme lunge til de forskellige vurderinger. I stedet skal alle lapperne hakkes, blandes godt sammen og analyseres ligeligt for de forskellige vurderinger. - Fjern den anden halvdel af lungen for flowcytometri (afsnit 7 nedenfor) og anbring den i en ikke-vævskulturbehandlet 24-brøndplade med hver brønd fyldt med 0,5 ml RP-10. Lad stå ved stuetemperatur indtil forarbejdning.
- Nasopharynx samling
- Ved nakken skal du bruge dissektionssaksen til at skære pelsen væk og derefter skære musklen væk og udsætte luftrøret.
BEMÆRK: Luftrøret er en rørlignende struktur placeret under musklen. - Placer små tang under luftrøret i en afstand af 1 cm fra musens kæbe for at stabilisere den. Brug dissektionssaks til forsigtigt at lave en 0,1 cm slids på den forreste del af luftrøret, og undgå at skære luftrøret helt.
- Klargør en 1 ml sprøjte fyldt med 0,5 ml PBS med 0,58 mm slange fastgjort til en 25 G kanyle. Opsaml næsevasken ved at indsætte slangen i luftrøret, der går opad mod nasopharynx. Når modstanden mærkes ind i næsehulen, skal du placere et mikrocentrifugerør ved næsen og langsomt skylle PBS gennem luftrøret for at opsamle næseskylningen.
- Placer musen i en udsat position. Sprøjt musens hoved med ethanol. Brug dissektionssaks til at klippe pelsen og mystacial pad for at udsætte musens hovedben.
- Brug dissektionsaksen til at skære 1 cm ned ad underkæbens sider og mellem øjnene. Brug tang til langsomt at trække ansigtsbenene væk fra kroppen for at udsætte næsehulen.
- Brug tang til forsigtigt at fjerne næsevævet og placere det i et rundt bundrør, der er fyldt med 0,5 ml PBS til homogenisering.
- Ved nakken skal du bruge dissektionssaksen til at skære pelsen væk og derefter skære musklen væk og udsætte luftrøret.
- For at homogenisere det opsamlede væv skal du først rengøre homogenisatorsonden ved at sætte den i 70% ethanol og tænde homogenisatoren ved 60% effekt i 30 s. Gentag trinnet i sterilt vand i 10 s. Homogeniser hvert væv i 1 min. Homogenisatorsonden rengøres i sterilt vand mellem hver prøve og i et frisk rør med 70% ethanol mellem hvert organ og prøvegruppen.
- Tælling af bakterietal
- Når alle organerne er høstet og homogeniseret, plade serielle fortyndinger på blod agar plader. For at beregne den samlede CFU skal du bruge 10 μL til at plade og notere det endelige volumen i ml for hver prøve. Plade nasopharynxprøverne på blodagarplader suppleret med 3 μg / ml gentamicin for at vælge væksten af S. pneumoniae , mens væksten af andre mikroorganismer, der koloniserer dette væv, hæmmes. Der inkuberes natten over ved 37 °C/5% CO2.
- For at opregne den bakterielle CFU for lungen og nasopharynx skal du først tælle kolonierne på blodagarpladerne. Brug derefter ligning (1) og ligning (2) til at beregne mængden pr. ml og det samlede tal.
Mængde pr. ml = antal kolonier × fortyndingsfaktor × 100 (1)
Samlet antal = mængde pr. ml × samlet volumen pr. prøve (2)
BEMÆRK: I ligning (1) bruges 100 til at gange, da 10 μL er belagt, hvilket er en 100 gange fortynding på 1 ml. Det samlede volumen pr. prøve i ligning (2) er fra trin 6.7.1, hvilket resulterer i detektionsgrænsen på 100 pr. organ. - For at opregne bakteriel CFU For bakteriæmi skal du først tælle kolonierne på blodagarpladerne. Brug derefter ligning (3) til at bestemme mængden pr. ml blod.
Mængde pr. ml blod = antal kolonier × fortyndingsfaktor × 100 × 10 (3)
BEMÆRK: I ligning (3) anvendes 100, da 10 μL er belagt, hvilket er en 100 gange fortynding på 1 ml, og 10 angiver en 1:10 fortynding af blodet i antikoagulantia. Dette resulterer i en detektionsgrænse på 1.000/ml.
7. Behandling af lungeprøver til flowcytometri
- Forbered det nødvendige medie som følger:
- Forbered RP-10 som beskrevet i trin 2.1.
- Forbered fordøjelsesbufferen ved at blande RP-10 med 2 mg/ml collagenase og 30 μL/ml DNase I.
- Forbered lysisbuffer ved at opløse 8,29 gNH4Cl, 1 gNaHCO3 og 0,038 g EDTA i 1 literH2O.
- Forbered 10x FACS-buffer ved at blande 450 ml HBSS med 50 ml varmeinaktiveret FBS og 5 g natriumazid.
- Forbered 1x FACS-buffer ved at fortynde 50 ml 10x FACS-buffer i 450 ml HBSS.
- Lungeprøverne tages fra trin 6.4.3 og anbringes i en plade med 24 huller. Tilsæt 500 μL fordøjelsesbuffer til hvert hul. Der inkuberes i 45 minutter op til 1 time ved 37 °C/5% CO2.
- Forfyld 50 ml koniske rør til hver prøve med 5 ml RP-10. Når inkubationen er overstået, placeres et 100 μm filter øverst på det 50 ml koniske rør og vådes med 1 ml RP-10.
- Brug en P-1000 mikropipette til at flytte de fordøjede lunger og placere dem på filteret. Brug stemplet på en 3 ml sprøjte til at mose organet. Skyl 2x med 1 ml RP-10 hver gang.
- Centrifuger prøverne ved 4 °C og 327 × g i 5 min. Supernatanten suges til syn, og pelletsen resuspenderes i 1 ml lysisbuffer. Lad det stå i 3 minutter for at tillade lysering af de røde blodlegemer. Neutralisere med 5 ml RP-10.
- Centrifuger prøverne ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter. Supernatanten suges op, pellettet resuspenderes i 1 ml RP-10, og der udtages 10 μL til tælling af prøverne.
- Centrifuger prøverne ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter. Supernatanten suges til syn, og pellet resuspenderes i RP-10 ved 2 × 10 6-4 × 106 celler/ml. Der tilsættes 60 μL af hver prøve i en plade med 96 brønde for at plette for de ønskede celletyper23, der er angivet i trin 7.9, tabel 5 og tabel 6.
- Drej pladen ved 4 °C og 327 × g i 5 min.
- I mellemtiden skal du forberede antistofmasterblandingerne, florescerende minus en (FMO'er) og enkeltpletkontroller med de ønskede antistoffer. For at plette for polymorfonukleære leukocytter (PMN'er), makrofager, monocytter, dendritiske celler og T-celler skal du bruge antistofferne og de endelige fortyndinger, der er anført i tabel 5 og tabel 6. Der anvendes et samlet volumen på 100 μL/hul af antistofblandingen. De fortyndinger, der er anført i tabellerne, følges for at bestemme det passende volumen af masterblandingen og de individuelle antistoffer, der kræves.
- Når centrifugeringen er færdig (trin 7.8), dekanteres supernatanten, pellets resuspenderes i 100 μL af antistofblandingerne, FMO'erne eller enkeltpletkontrollerne, og de inkuberes på is i 30 minutter i mørke.
- Cellerne vaskes 2x ved at tilsætte 150 μL FACS-buffer til hullerne og dreje pladen ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter.
- Når centrifugeringen er færdig, dekanteres supernatanten, pellets resuspenderes i 100 μL fikseringsbuffer og inkuberes på is i 20 minutter.
- Cellerne vaskes 2x ved at tilsætte 150 μL FACS-buffer til hullerne og dreje pladen ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter.
- Forbered mærkede FACS-rør med 200 μL FACS-buffer. Pellets resuspenderes i 150 μL FACS-buffer. Hver prøve filtreres individuelt i det tilsvarende FACS-rør ved hjælp af et 100 μm filter. Opbevares på is eller ved 4 °C og beskyttes mod lyset, indtil det er klar til analyse.
- Analyser cellerne ved hjælp af et flowcytometer.
8. Plaque-assay til tælling af IAV
- Forbered det nødvendige medie som følger:
- Forbered infektionsmediet ved at opløse 2,5 g bovin serumalbumin (BSA) i 40 ml DMEM under omrøring ved 37 °C i 10-20 minutter, indtil det er opløst. Filtrer steriliser i 460 ml DMEM.
- Forbered 2,4% mikrokrystallinsk cellulose ved at opløse 1,2 mg mikrokrystallinsk cellulose i 50 ml H2O. Autoklave på væskeindstillingen og opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered 5% BSA DMEM ved at opløse 2,5 g BSA i 40 ml DMEM under omrøring ved 37 ° C i 10-20 minutter. Tilsæt de resterende 10 ml DMEM for et slutvolumen på 50 ml. Filtersteriliseres og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 2x MEM/0,5% BSA ved at blande 1 ml 5% BSA DMEM med 9 ml 2x MEM.
- Forbered overlejringsmedium med lav viskositet ved at blande et 1:1-forhold på 2,4 % mikrokrystallinsk cellulose og 2 x MEM/0,5 % BSA med 1 mg/ml TPCK (hæmmer af chymotrypsin) trypsin.
- Forbered EMEM/10% FBS ved at blande 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml varmeinaktiveret FBS.
- Dyrk Madin-Darby hundenyre (MDCK) cellelinje. Tilsæt cellerne fra et købt hætteglas til 5 ml EMEM/10% FBS i en T-25 vævskulturbehandlet kolbe. Inkuber i 3-5 dage ved 37 °C/5% CO2 , indtil cellerne når 100% sammenløb. Kontroller for sammenløb som i trin 2.3.
- Fjern og kassér dyrkningsmediet, og skyl 2x med 5 ml PBS ved stuetemperatur. Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuber ved 37 °C / 5% CO2 i 10-15 minutter, indtil cellerne løsner sig. Når den er løftet, neutraliseres med 4 ml EMEM / 10% FBS for at opnå en cellesuspension ved 2 × 105 celler / ml.
- Frø MDCK-cellerne i en 12-brønds vævskulturbehandlet plade ved at tilføje 1 ml resuspenderede celler pr. Brønd (ved 2 × 105 celler / brønd) 1 dag før plaqueanalysen påbegyndes.
BEMÆRK: Sørg for, at cellerne når 100% sammenløb før brug og inkuber i længere tid, hvis det er nødvendigt for at nå sammenløb. - Til brug som standarder foretages 10 gange serielle fortyndinger (106-10 1) af IAV-stammen (af en kendt titer) i infektionsmediet angivet i trin 8.1.1. Der fremstilles 1,2 ml af hver fortynding for at teste i tre eksemplarer.
- Optø orgelhomogenaterne på is. Centrifuger på en bordplade ved 2.000 × g og opsaml den klare supernatant.
- Gentag trin 8.5, men med supernatanten fra prøverne i trin 8.6.
- Opsug mediet fra cellerne og vask 2x med 1 ml PBS for at fjerne al FBS.
- Der tilsættes 300 μL af hver standardfortyndingsprøve eller seriefortyndet prøve forsigtigt langs siden af hvert hul, begyndende ved den højeste fortynding til den laveste, og dette gøres i tre eksemplarer.
- Pladerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C/5% CO2, og pladen rystes hvert 10. minut i i alt 50 minutter. Sørg for at placere dem fladt i inkubatoren og ikke stable dem.
- Efter de 50 minutter vaskes cellerne 2x med 1 ml PBS.
- Der tilsættes 2 ml af overlejringssubstratet med lav viskositet i hvert hul undtagen hullerne med den laveste fortynding og ingen virus. Til dem tilsættes infektionsmedium og trypsin.
- Placer pladen tilbage i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO 2 i2-4 dage for at opnå plaques, der kan visualiseres med det blotte øje.
- Pladerne vaskes ved hurtigt at tilsætte 2 ml PBS i hvert hul fra siden, og ryst forsigtigt for at opslæmme det bundfældede overlejringsmedium med lav viskositet.
- Kassér hele væskevolumenet i brønden ved forsigtigt at pipettere mediet af.
- Vask gentages endnu en gang med 2 ml PBS i hvert hul, og kassér derefter hele væskevolumenet ved forsigtig pipettering.
- For at fastgøre plaques tilsættes 500 μL 4% paraformaldehyd i hver brønd, rystes og lad sidde i 30 minutter.
- Vask langsomt ned ad siden med 1 ml PBS; Kassér derefter forsigtigt væsken.
- Tilsæt 500 μL 1% krystalviolet (fortyndet i vand) til hvert hul for at dække cellemonolaget. Inkuber i 5 min.
- Vask med 1 ml ledningsvand. Sørg for at kassere al væsken i brønden ved forsigtig pipettering. Læg pladen på hovedet på en puslepude for at tørre natten over.
- Tæl plakaterne visuelt, og gem billederne på ethvert tilgængeligt billede.
Representative Results
Biofilmdyrket S. pneumoniae (figur 1A) blev brugt til at inficere mus (figur 1B) ved hjælp af et lille 10 μL podemateriale leveret intranasalt til ubedøvede mus. Dette podemateriale med lille volumen resulterer i konsistent pneumokoktransport begrænset til nasopharynx (figur 2A, +sp-grupper), samtidig med at systemisk spredning undgås (figur 2B, C, +sp-grupper). To dage efter intranasal podning blev musene inficeret med en murintilpasset H1N1 influenza A-virus A/PR/8/34 (IAV)22,30 leveret både intranasalt og intratrachealt for at opnå konsekvent levering af specifikke mængder til nasopharynx og lungerne 23.
Her blev modellen brugt til at sammenligne sygdomsforløbet efter virusinfektion hos mus intranasalt udfordret med forskellige stammer af S. pneumoniae, herunder TIGR4 og D39, som er invasive stammer, der resulterer i lungebetændelse, der udvikler sig til bakteriæmi, og EF3030, som er en otitis media-stamme 21,24,25,26,31. Sygdomspræsentationen hos S. pneumoniae/IAV co-inficerede mus var afhængig af bakteriestammen (figur 2). Mens der ikke var nogen signifikant forskel i bakterietal af nasopharynx (figur 2A) blandt nogen af stammerne, spredte S. pneumoniae TIGR4 og D39, men ikke EF3030, sig til lungerne 48 timer efter IAV-infektion (figur 2B). Fyrre procent af musene intranasalt inficeret med S. pneumoniae TIGR4 viste bakteriel spredning til lungerne, og af dem blev halvdelen af dem bakteriæmiske (figur 2C), i overensstemmelse med tidligere fund23.
Mus intranasalt inficeret med S. pneumoniae D39 viste mere effektiv spredning, fordi spredning til lungerne blev observeret hos 100% af de co-inficerede mus (figur 2B). I lighed med S. pneumoniae TIGR4 oplevede halvdelen af dem bakteriæmi (figur 2C). Ved sporing af den samlede overlevelse, uanset bakteriestammen, var overlevelsesraten for co-inficerede mus signifikant lavere end musene enkeltvis udfordret med S. pneumoniae alene for alle de testede stammer (figur 2D). Sammenlignet med kontrolmusene udfordret med IAV alene, viste musene intranasalt inficeret med S. pneumoniae TIGR4 og D39, men ikke EF3030, accelererede sygdomsfrekvenser. På dag 2 efter IAV-infektion var 30 % (D39) og 20 % (TIGR4) af musene bukket under, mens kontrolgrupperne, der kun havde IAV, ikke begyndte at bukke under før dag 5 efter udfordringen (figur 2D). Musene, der var inficeret med S. pneumoniae EF3030 og IAV, havde forsinkede symptomer, mere ligner kun IAV-kontrollerne (figur 2D). Disse resultater viser, at co-infektionsmodellen resulterer i sygdom hos unge sunde mus, der er bakteriestammeafhængig, hvilket gør den ideel til at udforske de bakterielle faktorer, der kræves på hvert trin i sygdomsprogressionen.
Denne model blev brugt til at vurdere tilstedeværelsen af forskellige immunceller i lungerne (celletyper og gatingstrategi i figur 3) efter IAV-infektion hos mus intranasalt podet med forskellige stammer af S. pneumoniae. Bakteriestammerne D39 og TIGR4, som spredte sig i lungerne efter IAV-infektion, fremkaldte en signifikant stigning over baseline (uinficeret) i tilstrømningen af inflammatoriske immunceller fra kredsløbet, såsom neutrofiler (PMN'er) og monocytter, mens EF3030 ikke gjorde det (figur 4A-C). IAV-infektion alene fremkaldte en signifikant stigning over baseline i tilstrømningen af immunceller, der er vigtige for værtsforsvar mod virusinfektion, såsom NK-celler og gamma-delta T-celler (figur 4A-C). Disse antivirale reaktioner blev signifikant afstumpet hos mus intranasalt inficeret med S. pneumoniae før viral udfordring (figur 4A-C). Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der vurderede cytokinresponser, der viste, at S. pneumoniae-vognen sløvede produktionen af type I-interferoner og forringede værtens evne til at kontrollere IAV-belastninger i lungerne23. Disse resultater viser, at co-infektionsmodellen kan bruges til at studere, hvordan immunresponser ændrer sig i mono versus polymikrobielle infektioner.
Denne model blev også brugt til at vurdere effekten af aldring på sygdomsforløbet efter IAV-infektion hos mus intranasalt inficeret med S. pneumoniae TIGR4. Hos enkeltinficerede mus varierede de virale titere ikke mellem de unge og ældre kohorter (figur 5A)23. Som i tidligere undersøgelser23 udviste gamle mus tidligere og signifikant mere alvorlige tegn på sygdom sammenlignet med deres unge kolleger, som det fremgår af de højere kliniske scorer (figur 5B). I overensstemmelse med sygdomssymptomerne begyndte gamle mus podet med S. pneumoniae at dø hurtigere inden for 24 timer efter IAV-infektion, og alle bukkede under for sygdommen, mens de unge kontroller overlevede infektionen med en signifikant højere (33%) sats (figur 5C). Disse resultater viser, at co-infektionsmodellen kan bruges til at opdage mere alvorlig sygdom hos sårbare værter, hvilket gør den ideel til at udforske værtsfaktorer, der giver resistens eller modtagelighed for co-infektion.
Figur 1: Tidslinje for co-infektion og organbehandling til vurdering af immuncelletilstrømning og patogenbyrde . (A) Streptococcus pneumoniae dyrkes i biofilm. (B) Mus podes intranasalt med 5 × 106 CFU af den angivne biofilmdyrkede S. pneumoniae-stamme for at etablere nasopharyngeal transport eller efterlades ubehandlet. Otteogfyrre timer senere bliver musene enten mock behandlet med PBS eller modtager 200 PFU af influenza A-virus PR8 intranasalt og 20 PFU intratrachealt. Mus overvåges over tid for klinisk sygdomsscore og overlevelse. (C) Ved 48 timer efter IAV-infektion vurderes bakteriel CFU eller viral PFU i de forskellige organer eller immuncelletilstrømning i lungerne. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheder; PFU = plakdannende enheder; IAV = influenza A-virus PR8; IT = intratrachealt; NP = nasopharyngealt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dobbelt intranasal/intratrakeal IAV-infektion hos S. pneumoniae-podede mus fører til bakteriel spredning og sygdom, der er afhængig af bakteriestammen. Unge (10-12 uger gamle) C57BL/6 (B6) hanmus blev smittet som i figur 1. Bakterietal i (A) nasopharynx, (B) lunger og (C) blod blev alle bestemt 48 timer efter IAV-infektion. (B,C) Procentdele angiver den brøkdel af mus, der udviste spredning. (D) Overlevelsen blev overvåget i 10 dage efter IAV-infektion. Samlede data fra (A,B) n = 5, (C) n = 11 og (D) n = 6 mus pr. gruppe vises. Hver cirkel svarer til en mus, og de stiplede linjer angiver detektionsgrænsen. (A-C) *, angiver en signifikant forskel (p < 0,05) mellem de angivne grupper som bestemt ved Kruskal-Wallis-testen. (D) *, angiver en signifikant forskel (p < 0,05) mellem +sp og Co-inf mus pr. bakteriestamme som bestemt ved log-rank (Mantel-Cox) testen. Forkortelser: +sp = mus inficeret intranasalt med bakterier kun ved hjælp af den angivne stamme; Co-inf = bakterieinficerede mus, der var inficeret med IAV; IAV = mus, der modtog influenza A-virus; CFU = kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immuncelle gating strategi. Lungerne blev høstet, og immuncelletilstrømningen blev bestemt af flowcytometri. Den repræsentative gating-strategi for de forskellige celletyper vises. (A) CD45+, levende enkeltceller blev gated on og procentdelene af (B) PMN'er (Ly6G+, CD11b+), makrofager (Ly6G-, Ly6C-, F480+) og monocytter (Ly6G-, Ly6C+), (C) DC'er (Ly6G-, CD11c+) og NK-celler (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ og CD8 (CD8+, TCRβ+) og CD4 (CD4+, TCRβ+ ) T-celler blev bestemt. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; SSC-W = sidespredning-topbredde; L/D = levende/døde; FMO = fluorescerende minus en; NK = naturlig dræber; PMN = polymorfonukleær leukocyt; DC = dendritisk celle; TCR = T-cellereceptor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Pulmonale immunresponser er bakteriestammeafhængige. Unge (10-12 uger gamle) C57BL/6 hanmus var enten uinficerede, enkeltvis podet med den angivne Streptococcus pneumoniae-stamme (+sp), enkeltvis udfordret med IAV (IAV) eller co-inficeret med S. pneumoniae og IAV (Co-inf). Otteogfyrre timer efter IAV-infektion (se det eksperimentelle design i figur 1) blev lungerne høstet, og immuncelletilstrømningen blev bestemt ved flowcytometri efter gating-strategien i figur 3. (A) De gennemsnitlige procentdele af hver angivet celletype inden for CD45-porten vises for alle behandlingsgrupperne på varmekortet. (B) Repræsentative prikplots af celletyper, der viste signifikante forskelle mellem behandlingerne, vises for hver musegruppe. (C) Procentdelene af de angivne immuncelletyper er vist. Hver cirkel svarer til en mus. (A,C) Der vises samlede data fra n = 5 mus pr. gruppe. *, indikerer en signifikant forskel (p < 0,05) mellem Co-inf og ikke-inficeret; $, angiver en signifikant mellem IAV og uinficeret; #, angiver en signifikant forskel mellem Co-inf og IAV alene. Signifikante forskelle mellem udfordringsgrupperne for hver celletype blev bestemt af ANOVA efterfulgt af Tukeys test. Forkortelser: NK = naturlig dræber; PMN = polymorfonukleær leukocyt; DC = dendritisk celle; TCR = T-cellereceptor; IAV = influenza A-virus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Aldring og øget værtsmodtagelighed for IAV/Streptococcus pneumoniae co-infektion. Unge (10-12 uger) og i alderen (21-22 måneder) C57BL/6 hanmus var co-inficeret med S. pneumoniae TIGR4 i.n. og IAV i.n. og i.t. (som i figur 1) eller enkeltvis udfordret med IAV alene. (A) Virale titere blev bestemt 48 timer senere. Stjerner angiver statistisk signifikans (p < 0,05) som bestemt af elevens t-test. Data samles fra n = 4 mus pr. gruppe. (B) Klinisk score og (C) overlevelse blev overvåget over tid. (B) Den gennemsnitlige ± SEM poolet fra n = 6 mus pr. gruppe vises. Stjerner indikerer statistisk signifikans (p < 0,05) mellem unge versus gamle mus på det angivne tidspunkt som bestemt af Mann-Whitney-testen. (C) Data samles fra n = 6 mus pr. gruppe. Stjerner indikerer statistisk signifikans (p < 0,05) mellem unge versus gamle mus som bestemt af log-rank (Mantel-Cox) testen. Forkortelser: IAV = influenza A-virus; i.n. = intranasalt; i.t. = intratrachealt; SEM = standardfejl i middelværdien. Figur 5A er genoptrykt med tilladelse fra Joma et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mix I lager til CDM | |
| Adenin | 0,1 g |
| D-Alanin | 0,25 g |
| CaCl2 Vandfri | 0,025 g |
| Mangansulfat | 0,03 g |
| Cyanocobalamin | 100 μL 10 mg/ml lager |
| Para-aminobenzoesyre | 400 μL 5 mg/ml lager |
| Pyridoxamin 2HCI | 100 μL 10 mg/ml lager |
| Mix II-lager til CDM | |
| Guanine | 0,05 g |
| Uracil | 0,05 g |
| Mix III-lager til CDM | |
| Jernnitrat 9H2O | 50 mg/ml |
| Jernsulfat 7H2O | 10 mg/ml |
| Mix IV-lager til CDM | |
| Beta-Nikotinamid-adenin-dinukleotid | 25 mg/ml |
Tabel 1: Mix I, II, III og IV lagre for CDM. Forkortelse: CDM = kemisk definerede medier.
| Vitamin Mix Stock til CDM | |
| Pyridoxal hydrochlorid | 0,8 g |
| Thiamin Cl2 | 0,4 g |
| Riboflavin | 0,4 g |
| Ca-pantothenat | 0,4 g |
| Biotin | 0,04 g |
| Folinsyre | 0,4 g |
| Niacinamid | 0,4 g |
Tabel 2: Vitamin Mix lager til CDM. Forkortelse: CDM = kemisk definerede medier.
| Aminosyrelager til CDM | |
| L-Alanin | 0,480 g |
| L-arginin | 0,250 g |
| L-asparagin: | 0,700 g |
| L-asparaginsyre | 0,600 g |
| L-Cystein | 1.000 g |
| L-cystin | 0,100 g |
| L-glutaminsyre | 0,200 g |
| L-glutamin | 0,780 g |
| L-glycin | 0,350 g |
| L-Histidin | 0,300 g |
| L-Isoleucin | 0,430 g |
| L-Leucin | 0,950 g |
| L-lysin | 0,880 g |
| L-methionin | 0,250 g |
| L-phenylalanin | 0,550 g |
| L-Prolin | 1.350 g |
| L-Serin | 0,680 g |
| L-Threonin | 0,450 g |
| L-tryptofan | 0,100 g |
| L-valin | 0,650 g |
Tabel 3: Aminosyrelager til CDM. Forkortelse: CDM = kemisk definerede medier.
| Startlager til CDM | |
| Dextrose | 1,0 g |
| Magnesiumsulfat-7-hydrat | 0,070 g |
| Kaliumphosphat Dibasisk | 0,02 g |
| Kaliumphosphat monobasisk | 0,1 g |
| Vandfrit natriumacetat | 0,45 g |
| Natriumbicarbonat | 0,25 g |
| Natriumphosphat dibasisk | 0,735 g |
| Natriumphosphat monobasisk | 0,32 g |
| Endelige tillæg til CDM | |
| Cholinchlorid | 0,1 g |
| L-Cystein HCI | 0,075 g |
| Natriumbicarbonat | 0,25 g |
Tabel 4: Startlager og endelige tillæg til CDM. Forkortelse: CDM = kemisk definerede medier.
| Antistof/fluorofor | Klon | Fortyndingsfaktor |
| L/D til UV-excitation | NIELSEN | 0.38888889 |
| Ly6G AF 488 | 1A8 | 0.25 |
| CD11b APC | M1/70 | 0.25 |
| CD11c PE | N418 | 0.18055556 |
| Mus Fc Blok | 2.4G2 | 0.11111111 |
| F4/80 PE Cy7 | BM8 | 0.18055556 |
| Ly6C BV605 | AL-21 | 0.25 |
| CD103 BV 421 | M290 | 0.18055556 |
| CD45 APC-eF-780 | 30-F11 | 0.18055556 |
Tabel 5: Antistofpanel 1.
| Antistof/fluorofor | Klon | Fortyndingsfaktor |
| L/D til UV-excitation | NIELSEN | 0.388888889 |
| TCR-β APC Cy7 | H57-597 | 0.180555556 |
| CD4 V450 (stillehavsblå) | RM4-5 | 0.25 |
| CD8 BV650 | 53-6.7 | 0.180555556 |
| Mus Fc Blok | 2.4G2 | 0.111111111 |
| CD45 PE | 30-F11 | 0.180555556 |
| CD3 AF488 | 145-2C11 | 0.180555556 |
| TCR- γΔ APC | GL-3 | 0.180555556 |
| NK1.1 AF 700 | PK136 | 0.180555556 |
Tabel 6: Antistofpanel 2.
Discussion
De fleste af de eksisterende S. pneumoniae / IAV co-infektion eksperimentelle undersøgelser er afhængige af bakteriel levering i lungerne af mus, der er præinficeret med IAV. Disse modeller har hjulpet med at identificere ændringer i lungemiljøet og systemisk immunrespons, der gør værten modtagelig for sekundær bakteriel infektion 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Disse modeller har imidlertid undladt at efterligne overgangen af S. pneumoniae fra en asymptomatisk kolonisator til et patogen, der kan forårsage alvorlige lunge- og systemiske infektioner. Desuden er disse modeller ikke egnede til at studere værtsfaktorer og værtspatogeninteraktioner i det øvre luftveje, der bidrager til modtagelighed for infektion. En tidligere model for bevægelse af pneumokokker fra nasopharynx til lungen efter IAV-infektion var afhængig af bakteriel infektion i nasopharynx efterfulgt af virusinfektion. Det kunne imidlertid ikke reproducere de alvorlige tegn på sygdom, der blev observeret hos humane patienter21. Den modificerede murininfektionsmodel, der er beskrevet her, rekapitulerer overgangen af S. pneumoniae fra asymptomatisk transport til et patogen, der forårsager alvorlig klinisk sygdom.
Et kritisk trin i denne model er at etablere S. pneumoniae infektion i nasopharynx. Streptococcus pneumoniae danner biofilm og koloniserer nasopharynx med forskellige virkningsgrader 21,38. For at etablere konsistent infektion kræves mindst 5 × 106 CFU af de biofilmdyrkede bakteriestammer, der hidtil er testet23. Det anbefales, at enhver ny bakteriestamme testes for stabil infektion i nasopharynx før virusinfektion. For viral co-infektion har tidligere undersøgelser vist, at intranasal infektion med IAV er nødvendig for spredning af bakterierne fra nasopharynx21,22,23. I disse tidligere undersøgelser blev 500 PFU IAV til intranasal levering anvendt, mens 200 PFU i denne undersøgelse var tilstrækkelige til at øge bakterietallet i nasopharynx. IAV-infektion er ikke begrænset til de øvre luftveje og kan sprede sig til lungerne39,40, hvilket er nøglen til at gøre lungemiljøet mere tilladeligt for bakteriel infektion15,16,41. Levering af IAV til lungerne kan opnås ved enten intranasal levering eller intratracheal installation af bedøvede mus. Tidligere arbejde med BALB / cByJ-mus viste, at intranasal levering resulterer i viral lungebetændelse21; podningens adgang til lungerne efter intranasal podning er dog mere begrænset hos C57BL/6-mus. I C57BL/6-mus kræves intratrakeal installation for konsekvent levering af virus23. I denne model fremskynder tidligere bakteriekolonisering præsentationen af sygdomssymptomer efter virusinfektion23. Da virusinfektion i sig selv kan forårsage sygdomssymptomer med potentiel variation i kinetik, anbefales det først at teste en række doser for enhver ny viral stamme, der testes, og vælge en dosis, der afslører accelereret kinetik hos co-inficerede værter.
Lungerne giver en anden kritisk aflæsning til sygdomsevaluering i denne model. Til vurdering af patogenbyrde og immuncelletilstrømning kan en lunge fra samme mus anvendes. Men da infektions- og betændelsessværhedsgraden kan variere mellem lapper, anbefales det ikke at tage forskellige lobes af samme lunge til de forskellige vurderinger. I stedet kan alle lapperne hakkes i små stykker, blandes godt sammen og derefter analyseres ligeligt for de forskellige vurderinger. Tilsvarende kan nasopharynx anvendes til tælling af bakteriel CFU eller viral PFU og immunrespons. Antallet af celler opnået fra vaske og væv er imidlertid for lavt til at udføre flowcytometri uden at samle prøverne fra mus inden for samme gruppe. Alternativt kan inflammation i nasopharynx vurderes histologisk23.
Et kritisk træk ved denne model er, at den rekapitulerer den kliniske sygdom, der ses hos patienter. Hos mennesker resulterer sekundær pneumokokpneumoni efter IAV-infektion ofte i tydelige tegn på sygdom, herunder hoste, dyspnø, feber og muskelsmerter, der kan føre til hospitalsindlæggelser, respirationssvigt og endda død 8,15,42,43. Denne model rekapitulerer de alvorlige tegn på klinisk sygdom, der observeres hos mennesker med hensyn til vejrtrækningsbesvær (afspejlet i vejrtrækningsscoren) og generel utilpashed (afspejlet i kropsholdning og bevægelsesscore), der vises af musene, samt død hos nogle af de raske unge kontroller. De forværrede sygdomssymptomer hos co-inficerede mus er sandsynligvis et resultat af både bakteriel spredning til lungerne og nedsat viral clearance hos mus med pneumokokvogn23. En begrænsning af modellen er, at forekomsten af klinisk sygdom og bakteriel spredning fra nasopharynx varierer mellem mus og påvirkes af bakteriestamme, værtsalder og genotype21,22,23. Afspejler dette, for invasive stammer, kan progressionen fra lokaliseret infektion (uden påviselig bakteriæmi) til døden forekomme inden for 24 timer. For en sand vurdering af systemisk spredning bør bakteriæmi derfor følges over kortere intervaller (hver 6-12 timer). På samme måde kan sygdomsscoren ændre sig hurtigt, især i de første 72 timer efter co-infektion. For nøje at spore sygdomssymptomerne anbefales det derfor at overvåge mus tre gange om dagen i dag 1-3 efter IAV-infektion.
Sammenfattende replikerer denne model bevægelsen af S. pneumoniae fra en asymptomatisk kolonisator af nasopharynx til et patogen, der er i stand til at forårsage lunge- og systemisk sygdom ved IAV-infektion. I denne model udløser IAV overgangen af S. pneumoniae via ændring af bakteriel adfærd i nasopharynx, øget bakteriel spredning til lungen og ændring af antibakteriel immunitet23. På samme måde sløver bakteriel transport de antivirale immunresponser og forringer IAV-clearance fra lungerne23. Dette gør denne model ideel til at analysere ændringer i immunresponser i enkelt- versus polymikrobielle infektioner. Derudover er sygdomsforløbet efter co-infektion delvist afhængigt af stammen af pneumokokker, der er til stede i nasopharynx. Derfor er modellen velegnet til at dissekere de bakterielle faktorer, der kræves for asymptomatisk kolonisering versus patogen overgang af S. pneumoniae. Endelig reproducerer denne model aldringens modtagelighed for co-infektioner, og selvom dette ikke blev testet her, kan den let bruges til at vurdere virkningen af værtsbaggrund på sygdomsforløbet. Afslutningsvis giver adskillelse af transport og sygdom i forskellige trin mulighed for at analysere de genetiske varianter af både patogenerne og værten, hvilket muliggør en detaljeret undersøgelse af interaktionerne mellem en vigtig pathobiont og værten i forskellige faser af sygdomsprogression. Fremadrettet kan denne model bruges til at skræddersy behandlingsmuligheder for sårbare værter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Nick Lenhard for den kritiske læsning og redigering af dette manuskript. Vi vil også gerne takke Andrew Camilli og Anthony Campagnari for bakteriestammerne og Bruce Davidson for virusstammerne. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) til J.L. og National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) til E.N.B.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
| 96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
| 100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
| Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
| Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
| BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
| BD Fortessa | Flow cytometer | ||
| BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
| BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
| Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
| Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
| CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
| CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
| CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
| CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
| CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
| CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
| Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
| Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
| Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
| Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
| D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
| D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
| D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
| Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
| Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
| EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
| F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
| FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
| Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
| Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
| Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
| Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
| Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
| Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
| Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
| Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
| Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
| Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
| Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
| Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
| Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
| L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
| L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
| L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
| L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
| L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
| L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
| L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
| L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
| L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
| LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
| L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
| L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
| L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
| L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
| Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
| L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
| L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
| L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
| L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
| L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
| L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
| Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
| Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
| Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
| Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
| MilQ water | Ultra-pure water | ||
| Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
| MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
| NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
| Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
| NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
| Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
| Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
| Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
| Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
| Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
| Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
| Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
| TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
| TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
| Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
| Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
| Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
| TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
| Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
| Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |
References
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews Microbiology. 6 (4), 288-301 (2008).
- Obaro, S., Adegbola, R. The pneumococcus: Carriage, disease and conjugate vaccines. Journal of Medical Microbiology. 51 (2), 98-104 (2002).
- Chong, C. P., Street, P. R. Pneumonia in the elderly: A review of the epidemiology, pathogenesis, microbiology, and clinical features. Southern Medical Journal. 101 (11), 1141-1145 (2008).
- Kadioglu, A., Andrew, P. W. Susceptibility and resistance to pneumococcal disease in mice. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 4 (3), 241-247 (2005).
- Ganie, F., et al. Structural, genetic, and serological elucidation of Streptococcus pneumoniae serogroup 24 serotypes: Discovery of a new serotype, 24C, with a variable capsule structure. Journal of Clinical Microbiology. 59 (7), 0054021 (2021).
- Centers for Disease Control and Prevention. Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Shrestha, S., et al. Identifying the interaction between influenza and pneumococcal pneumonia using incidence data. Science Translational Medicine. 5 (191), (2013).
- McCullers, J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 571-582 (2006).
- Pneumococcal Disease Global Pneumococcal Disease and Vaccine. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/pneumococcal/global.html (2018).
- Grudzinska, F. S., et al. Neutrophils in community-acquired pneumonia: Parallels in dysfunction at the extremes of age. Thorax. 75 (2), 164-171 (2020).
- Boe, D. M., Boule, L. A., Kovacs, E. J. Innate immune responses in the ageing lung. Clinical and Experimental Immunology. 187 (1), 16-25 (2017).
- Krone, C. L., van de Groep, K., Trzcinski, K., Sanders, E. A., Bogaert, D. Immunosenescence and pneumococcal disease: An imbalance in host-pathogen interactions. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (2), 141-153 (2014).
- Cho, S. J., et al. Decreased NLRP3 inflammasome expression in aged lung may contribute to increased susceptibility to secondary Streptococcus pneumoniae infection. Experimental Gerontology. 105, 40-46 (2018).
- Disease Burden of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/flu/about/burden/index.html (2018).
- McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 252-262 (2014).
- McCullers, J. A., Rehg, J. E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae: Characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. The Journal of Infectious Diseases. 186 (3), 341-350 (2002).
- Metzger, D. W., Sun, K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza. Journal of Immunology. 191 (5), 2047-2052 (2013).
- Chao, Y., Marks, L. R., Pettigrew, M. M., Hakansson, A. P. Streptococcus pneumoniae biofilm formation and dispersion during colonization and disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 194 (2014).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: The key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases. 4 (3), 144-154 (2004).
- Simell, B., et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 11 (7), 841-855 (2012).
- Marks, L. R., Davidson, B. A., Knight, P. R., Hakansson, A. P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 4 (4), 00438 (2013).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Sauberan, S. L., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio. 9 (1), 02089 (2018).
- Joma, B. H., et al. A murine model for enhancement of Streptococcus pneumoniae pathogenicity upon viral infection and advanced age. Infection and Immunity. 89 (8), 0047120 (2021).
- Andersson, B., et al. Identification of an active disaccharide unit of a glycoconjugate receptor for pneumococci attaching to human pharyngeal epithelial cells. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 559-570 (1983).
- Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of Experimental Medicine. 79 (2), 137-158 (1944).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
- Tothpal, A., Desobry, K., Joshi, S. S., Wyllie, A. L., Weinberger, D. M. Variation of growth characteristics of pneumococcus with environmental conditions. BMC Microbiology. 19 (1), 304 (2019).
- Bou Ghanem, E. N., et al. Extracellular adenosine protects against Streptococcus pneumoniae lung infection by regulating pulmonary neutrophil recruitment. PLoS Pathogens. 11 (8), 1005126 (2015).
- Bou Ghanem, E. N., et al. The alpha-tocopherol form of vitamin E boosts elastase activity of human PMNs and their ability to kill Streptococcus pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 161 (2017).
- Tait, A. R., Davidson, B. A., Johnson, K. J., Remick, D. G., Knight, P. R. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice. Anesthesia & Analgesia. 76 (5), 1106-1113 (1993).
- Aaberge, I. S., Eng, J., Lermark, G., Lovik, M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: A standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microbial Pathogenesis. 18 (2), 141-152 (1995).
- McCullers, J. A., Bartmess, K. C. Role of neuraminidase in lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae. The Journal of Infectious Diseases. 187 (6), 1000-1009 (2003).
- Smith, A. M., McCullers, J. A. Secondary bacterial infections in influenza virus infection pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 385, 327-356 (2014).
- Cundell, D. R., Gerard, N. P., Gerard, C., Idanpaan-Heikkila, I., Tuomanen, E. I. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor. Nature. 377 (6548), 435-438 (1995).
- Ballinger, M. N., Standiford, T. J. Postinfluenza bacterial pneumonia: Host defenses gone awry. Journal of Interferon & Cytokine Research. 30 (9), 643-652 (2010).
- Sun, K., Metzger, D. W. Inhibition of pulmonary antibacterial defense by interferon-gamma during recovery from influenza infection. Nature Medicine. 14 (5), 558-564 (2008).
- Nakamura, S., Davis, K. M., Weiser, J. N. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3657-3665 (2011).
- Blanchette-Cain, K., et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. mBio. 4 (5), 00745 (2013).
- Rello, J., Pop-Vicas, A. Clinical review: Primary influenza viral pneumonia. Critical Care. 13 (6), 235 (2009).
- Torres, A., Loeches, I. M., Sligl, W., Lee, N. Severe flu management: A point of view. Intensive Care Medicine. 46 (2), 153-162 (2020).
- Bakaletz, L. O.
- Palacios, G., et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS One. 4 (12), 8540 (2009).
- Dhanoa, A., Fang, N. C., Hassan, S. S., Kaniappan, P., Rajasekaram, G. Epidemiology and clinical characteristics of hospitalized patients with pandemic influenza A (H1N1) 2009 infections: The effects of bacterial coinfection. Virology Journal. 8, 501 (2011).
