Denna artikel beskriver en ny musmodell för övergången av pneumokocker från en asymptomatisk kolonisator till en sjukdomsframkallande patogen under virusinfektion. Denna modell kan lätt anpassas för att studera polymikrobiella och värd-patogeninteraktioner under de olika faserna av sjukdomsprogression och över olika värdar.
Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är en asymptomatisk kolonisator av nasofarynx hos de flesta individer men kan utvecklas till en lung- och systemisk patogen vid influensa A-virus (IAV) infektion. Hög ålder ökar värdens mottaglighet för sekundär pneumokockpneumoni och är förknippad med försämrade sjukdomsutfall. Värdfaktorerna som driver dessa processer är inte väldefinierade, delvis på grund av brist på djurmodeller som reproducerar övergången från asymptomatisk kolonisering till svår klinisk sjukdom.
Denna artikel beskriver en ny musmodell som återskapar övergången av pneumokocker från asymtomatisk bärare till sjukdom vid virusinfektion. I denna modell inokuleras möss först intranasalt med biofilmodlade pneumokocker för att etablera asymtomatisk transport, följt av IAV-infektion i både nasofarynx och lungor. Detta resulterar i bakteriell spridning till lungorna, lunginflammation och uppenbara tecken på sjukdom som kan utvecklas till dödlighet. Graden av sjukdom är beroende av bakteriestammen och värdfaktorerna.
Det är viktigt att denna modell reproducerar mottagligheten av åldrande, för jämfört med unga möss visar gamla möss allvarligare klinisk sjukdom och ger efter för sjukdom oftare. Genom att separera vagn och sjukdom i distinkta steg och ge möjlighet att analysera de genetiska varianterna av både patogenen och värden, tillåter denna S. pneumoniae / IAV-saminfektionsmodell detaljerad undersökning av interaktionerna mellan en viktig patobiont och värden i olika faser av sjukdomsprogression. Denna modell kan också fungera som ett viktigt verktyg för att identifiera potentiella terapeutiska mål mot sekundär pneumokockpneumoni hos mottagliga värdar.
Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är grampositiva bakterier som asymptomatiskt bor i nasofarynx hos de flesta friska individer 1,2. Främjas av faktorer som inte är helt definierade kan pneumokocker övergå från godartade kolonisatorer av nasofarynx till patogener som sprider sig till andra organ vilket resulterar i allvarliga infektioner, inklusive otitis media, lunginflammation och bakteriemi3. Pneumokocksjukdomspresentationen är delvis beroende av stamspecifika skillnader, inklusive serotypen, som är baserad på sammansättningen av kapselpolysackarider. Det har hittills karakteriserats över 100 serotyper, och vissa är förknippade med mer invasiva infektioner 4,5. Flera andra faktorer ökar risken för pneumokocksjukdom. En sådan faktor är virusinfektion, där risken för pneumokockpneumoni ökar 100-faldigt med IAV 6,7. Historiskt sett är S. pneumoniae en av de vanligaste orsakerna till sekundär bakteriell lunginflammation efter influensa och är förknippad med sämre resultat8. En annan stor riskfaktor är hög ålder. Faktum är att S. pneumoniae är den främsta orsaken till samhällsförvärvad bakteriell lunginflammation hos äldre individer över 65 år 9,10. Äldre individer står för majoriteten (>75%) av dödsfall på grund av lunginflammation och influensa, vilket indikerar att de två riskfaktorerna åldrande och IAV-infektion – synergistiskt förvärrar sjukdomskänsligheten11,12,13,14. De mekanismer genom vilka virusinfektion föranleder övergången av pneumokocker från asymptomatisk kolonisator till invasiv patogen och hur detta formas av värdfaktorer är dock fortfarande dåligt definierade. Detta beror till stor del på frånvaron av en liten djurmodell som rekapitulerar övergången från asymptomatisk pneumokockkolonisering till kritisk klinisk sjukdom.
Saminfektionsstudier har klassiskt modellerats på möss inokulerade med pneumokocker direkt i lungorna 7 dagar efter influensainfektion15,16. Detta reproducerar mottagligheten för sekundär bakteriell lunginflammation och är idealisk för att studera hur antivirala immunsvar försämrar antibakteriella försvar17. Longitudinella studier på människor har dock visat att pneumokocktransport i nasofarynx, där bakterierna kan bilda asymtomatiska biofilmer18, är enhetligt associerad med invasiva sjukdomar19,20. Bakteriella isolat från infektioner i mellanörat, lungan och blodet är genetiskt identiska med de som finns i nasofarynx20. För att studera övergången från asymtomatisk bärare till invasiv sjukdom efter IAV-infektion etablerades en modell där möss administrerades intranasalt biofilmodlade pneumokocker följt av IAV-infektion av nasofarynx21,22. Virusinfektion i de övre luftvägarna ledde till förändringar i värdmiljön som ledde till spridning av pneumokocker från biofilmer och deras spridning till de nedre luftvägarna21. Dessa dispergerade bakterier hade uppreglerat uttrycket av virulensfaktorer som är viktiga för infektion och omvandlat dem från kolonisatorer till patogener21. Dessa observationer belyser den komplexa interaktionen mellan viruset, värden och bakterierna och visar att förändringarna i värden som utlöses av virusinfektion har en direkt inverkan på pneumokockbeteendet, vilket i sin tur förändrar bakterieinfektionens gång. Denna modell misslyckas emellertid med att rekapitulera de allvarliga tecken på sjukdom som observerats hos människor, troligen för att viruset är begränsat till näshålan, och de systemiska effekterna av virusinfektion på värdimmunitet och lungskador rekapituleras inte.
Vi etablerade nyligen en modell som innehåller den komplexa interaktionen mellan värden och patogenerna men också närmare efterliknar sjukdomens svårighetsgrad som observerats hos människor23. I denna modell infekteras möss först intranasalt med biofilmodlade pneumokocker för att etablera asymtomatisk transport, följt av IAV-infektion i både nasofarynx och lungor. Detta resulterade i bakteriell spridning till lungorna, lunginflammation och sjukdom som utvecklades till dödlighet hos en bråkdel av unga möss23. Denna tidigare studie visade att både virus- och bakterieinfektion förändrade värdförsvaret: virusinfektion främjade bakteriell spridning och tidigare bakteriekolonisering försämrade värdens förmåga att kontrollera lung IAV-nivåer23. Undersökning av immunsvaret avslöjade att IAV-infektion minskade den antibakteriella aktiviteten hos neutrofiler, medan bakteriekolonisering avtrubbade typ I-interferonsvaret som är kritiskt för antiviralt försvar23. Det är viktigt att denna modell reproducerade mottagligheten av åldrande. Jämfört med unga möss visade gamla möss tecken på sjukdom tidigare, visade allvarligare klinisk sjukdom och gav efter för infektion oftare23. Arbetet som presenteras i detta manuskript visar att graden av sjukdom också är beroende av bakteriestammen, eftersom invasiva pneumokockstammar visar effektivare spridning vid IAV-infektion, visar mer uppenbara tecken på lunginflammation och resulterar i accelererade sjukdomsfrekvenser jämfört med icke-invasiva stammar. Således möjliggör denna S. pneumoniae / IAV-saminfektionsmodell detaljerad undersökning av både patogen- och värdfaktorer och är väl lämpad för att studera immunsvar mot polymikrobiella infektioner vid de olika faserna av sjukdomsprogression.
De flesta av de befintliga experimentella studierna av S. pneumoniae / IAV-saminfektion är beroende av bakteriell leverans i lungorna hos möss som är preinfekterade med IAV. Dessa modeller har hjälpt till att identifiera förändringar i lungmiljön och systemiskt immunsvar som gör värden mottaglig för sekundär bakteriell infektion 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Dessa modeller har emellertid misslyckats med att efterlikna övergången av S. pneumoniae från en asymptomatisk kolonisator till en patogen som kan orsaka allvarliga lung- och systemiska infektioner. Vidare är dessa modeller inte lämpliga för att studera värdfaktorer och värd-patogeninteraktioner i övre luftvägarna som bidrar till mottaglighet för infektion. En tidigare modell för förflyttning av pneumokocker från nasofarynx till lungan efter IAV-infektion förlitade sig på bakteriell infektion i nasofarynx följt av virusinfektion. Det misslyckades dock med att reproducera de allvarliga tecken på sjukdom som observerats hos mänskliga patienter21. Den modifierade murina infektionsmodellen som beskrivs här rekapitulerar övergången av S. pneumoniae från asymptomatisk vagn till en patogen som orsakar allvarlig klinisk sjukdom.
Ett kritiskt steg i denna modell är att etablera S. pneumoniae-infektion i nasofarynxen. Streptococcus pneumoniae bildar biofilmer och koloniserar nasofarynx vid olika effektivitet21,38. För att etablera konsekvent infektion krävs minst 5 × 106 CFU av de biofilmodlade bakteriestammar som hittills testats23. Det rekommenderas att alla nya bakteriestammar testas för stabil infektion i nasofarynx före virusinfektion. För viral saminfektion har tidigare studier funnit att intranasal infektion med IAV krävs för spridning av bakterierna från nasofarynx21,22,23. I dessa tidigare studier användes 500 PFU av IAV för intranasal leverans, medan i denna studie var 200 PFU tillräckliga för att öka bakterieantalet i nasofarynxen. IAV-infektion är inte begränsad till de övre luftvägarna och kan spridas till lungorna39,40, vilket är nyckeln till att göra lungmiljön mer tillåtande för bakteriell infektion15,16,41. Leverans av IAV till lungorna kan uppnås genom antingen intranasal leverans eller intratrakeal installation av bedövade möss. Tidigare arbete med BALB / cByJ-möss fann att intranasal leverans resulterar i viral lunginflammation21; inokulumets tillgång till lungorna efter intranasal inokulering är dock mer begränsad hos C57BL/6-möss. Hos möss med C57BL/6 krävs intratrakeal installation för konsekvent tillförsel av virus23. I denna modell accelererar tidigare bakteriekolonisering presentationen av sjukdomssymtom efter virusinfektion23. Eftersom virusinfektion i sig kan orsaka sjukdomssymtom med potentiell variation i kinetik, rekommenderas att man först testar en rad doser för alla nya virusstammar som testas och väljer en dos som avslöjar accelererad kinetik hos saminfekterade värdar.
Lungorna ger en annan kritisk avläsning för sjukdomsutvärdering i denna modell. För bedömning av patogenbörda och tillströmning av immunceller kan en lunga från samma mus användas. Men eftersom infektionens och inflammationens svårighetsgrad kan skilja sig åt mellan loberna, rekommenderas det att inte ta olika lober av samma lunga för de olika bedömningarna. Snarare kan alla loberna hackas i små bitar, blandas väl ihop och sedan analyseras lika för de olika bedömningarna. På liknande sätt kan nasofarynx användas för räkning av bakteriell CFU eller viral PFU och immunsvar. Antalet celler som erhålls från tvättar och vävnader är dock för lågt för att utföra flödescytometri utan att samla proverna från möss inom samma grupp. Alternativt kan inflammation i nasofarynx bedömas histologiskt23.
Ett kritiskt inslag i denna modell är att den rekapitulerar den kliniska sjukdomen som ses hos patienter. Hos människor resulterar sekundär pneumokockpneumoni efter IAV-infektion ofta i uppenbara tecken på sjukdom, inklusive hosta, dyspné, feber och muskelvärk som kan leda till sjukhusvistelser, andningssvikt och till och med död 8,15,42,43. Denna modell rekapitulerar de allvarliga tecken på klinisk sjukdom som observerats hos människor när det gäller andningssvårigheter (återspeglas i andningspoängen) och övergripande sjukdom (återspeglas i hållning och rörelsepoäng) som visas av mössen, liksom död hos några av de friska unga kontrollerna. De förvärrade sjukdomssymtomen hos saminfekterade möss är sannolikt ett resultat av både bakteriell spridning till lungorna och nedsatt virusclearance hos möss med pneumokock vagn23. En begränsning med modellen är att förekomsten av klinisk sjukdom och bakteriespridning från nasofarynx varierar mellan möss och påverkas av bakteriestam, värdålder och genotyp21,22,23. För invasiva stammar kan progressionen från lokaliserad infektion (utan detekterbar bakteriemi) till döden ske inom 24 timmar. För en sann bedömning av systemisk spridning bör därför bakteriemi följas med kortare intervall (var 6-12 h). På samma sätt kan sjukdomspoängen förändras snabbt, särskilt under de första 72 timmarna efter samtidig infektion. För att noggrant spåra sjukdomssymptomen är det därför lämpligt att övervaka möss tre gånger per dag i dag 1-3 efter IAV-infektion.
Sammanfattningsvis replikerar denna modell rörelsen av S. pneumoniae från en asymptomatisk kolonisator av nasofarynx till en patogen som kan orsaka lung- och systemisk sjukdom vid IAV-infektion. I denna modell utlöser IAV övergången av S. pneumoniae genom att modifiera bakteriebeteendet i nasofarynx, öka bakteriell spridning till lungan och förändra antibakteriell immunitet23. På samma sätt avtrubbar bakteriell vagn de antivirala immunsvaren och försämrar IAV-clearance från lungorna23. Detta gör denna modell idealisk för att analysera förändringar i immunsvar vid enstaka kontra polymikrobiella infektioner. Dessutom är sjukdomsförloppet efter samtidig infektion delvis beroende av stammen av pneumokocker som finns i nasofarynxen. Därför är modellen lämplig för att dissekera de bakteriella faktorer som krävs för asymtomatisk kolonisering kontra patogen övergång av S. pneumoniae. Slutligen reproducerar denna modell mottagligheten av åldrande för saminfektioner, och även om detta inte testades här, kan det enkelt användas för att bedöma effekterna av värdbakgrund på sjukdomsförloppet. Sammanfattningsvis ger separering av vagn och sjukdom i distinkta steg möjlighet att analysera de genetiska varianterna av både patogenerna och värden, vilket möjliggör detaljerad undersökning av interaktionerna mellan en viktig patobiont och värden i olika faser av sjukdomsprogression. Framöver kan denna modell användas för att skräddarsy behandlingsalternativ för utsatta värdar.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Nick Lenhard för den kritiska läsningen och redigeringen av detta manuskript. Vi vill också tacka Andrew Camilli och Anthony Campagnari för bakteriestammarna och Bruce Davidson för virusstammarna. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) till J.L. och National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) till E.N.B.G.
4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
BD Fortessa | Flow cytometer | ||
BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
MilQ water | Ultra-pure water | ||
Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |