Isolering av små preantralfollikler fra bovin eggstokk ved hjelp av en kombinasjon av fragmentering, homogenisering og seriell filtrering

Summary

Fremme studien av preantral follikulogenese krever effektive metoder for follikelisolasjon fra enkle eggstokkene. Presentert her er en strømlinjeformet, mekanisk protokoll for follikelisolasjon fra okse eggstokkene ved hjelp av en vevskrubber og homogenisator. Denne metoden tillater innsamling av et stort antall levedyktige preantralfollikler fra en enkelt eggstokk.

Abstract

Å forstå hele prosessen med pattedyrfollikulogenese er avgjørende for å forbedre assistert reproduksjonsteknologi hos husdyr, mennesker og truede arter. Forskning har for det meste vært begrenset til antral og store preantralfollikler på grunn av vanskeligheter med isolering av mindre preantralfollikler, spesielt hos store pattedyr som storfearter. Dette arbeidet presenterer en effektiv tilnærming til å hente et stort antall små preantralfollikler fra en enkelt bovin eggstokk. Cortex av individuelle okse eggstokkene ble skåret inn i 500 μm kuber ved hjelp av en vevskrubber og homogenisert i 6 minutter ved 9.000-11.000 o / min ved hjelp av en 10 mm sonde. Store rusk ble skilt fra homogenatet ved hjelp av en osteklut, etterfulgt av seriell filtrering gjennom 300 μm og 40 μm cellesiler. Innholdet som ble beholdt i silen på 40 μm ble skyllet inn i en søkeskål, hvor follikler ble identifisert og samlet inn i en dråpe medium. Levedyktigheten til de oppsamlede folliklene ble testet via trypanblå farging. Denne metoden muliggjør isolering av et stort antall levedyktige små preantralfollikler fra en enkelt bovin eggstokk på ca. 90 minutter. Det er viktig at denne metoden er helt mekanisk og unngår bruk av enzymer for å dissosiere vevet, noe som kan skade folliklene. Folliklene oppnådd ved bruk av denne protokollen kan brukes til nedstrøms applikasjoner som isolering av RNA for RT-qPCR, immunlokalisering av spesifikke proteiner og in vitro-kultur .

Introduction

Ovariefollikler er de funksjonelle enhetene i eggstokken, ansvarlig for produksjon av gameten (oocyten) samt hormoner som er kritiske for reproduktiv funksjon og generell helse. Primordial follikler dannes i eggstokken under fosterutvikling eller i nyfødtperioden avhengig av art¹, og de utgjør en kvinnes eggstokkreserve. Follikulær vekst begynner med aktivering av primordiale follikler som forlater hvilebassenget og går inn i vekstfasen. Preantral follikulogenese, som omfatter alle follikelstadier før antrumutvikling, er en svært dynamisk prosess som krever synkrone morfologiske og metabolske endringer i oocytten og de omkringliggende granulosacellene, drevet av tett kommunikasjon mellom disse to celletypene ^2,3. Preantralfollikler utgjør flertallet av follikulære enheter som finnes i eggstokken til enhver tid⁴. Utvikling gjennom preantrale stadier av follikulogenese anslås å være flere uker lenger enn antral utvikling^5,6, og denne gangen er nødvendig for at oocyt- og somatiske celler skal oppnå tilstrekkelig modenhet til å gå inn i sluttfasen av utviklingen (dvs. antralstadiet), og forberede seg på eggløsning, befruktning og embryonal utvikling 7,8,9.

Mye av dagens kunnskap om ovarie preantral follikulogenese kommer fra musemodeller^10,11,12,13, delvis på grunn av det enkle å gjenopprette et stort antall av disse folliklene fra en mindre og mindre fibrøs eggstokk. Selv om rapporter om isolering av et stort antall preantrale follikler fra storfe eggstokkene dateres tilbake ca 30 år¹⁴, har en mer fullstendig forståelse av prosessene som regulerer utviklingen av disse tidlige folliklene forblitt urealisert, hovedsakelig på grunn av mangel på optimaliserte, effektive og repeterbare metoder for å hente tilstrekkelig antall levedyktige preantralfollikler, spesielt i tidlige utviklingsstadier. Med den økende interessen for å bevare eggstokkreserven for fremtidig bruk i assistert befruktning hos mennesker, blir kyr en attraktiv modell på grunn av deres mer like eggstokkstruktur¹⁵. Imidlertid er okseovarieet markant rikere i kollagen sammenlignet med musens eggstokk¹⁶, noe som gjør mekanisk isolasjon ved hjelp av metoder beskrevet for musen svært ineffektiv. Arbeidet med å utvide fertilitetsbevaringsteknikker inkluderer fullstendig in vitro-vekst av preantralfollikler til antralstadiet, etterfulgt av in vitro-modning (IVM) av de vedlagte oocytter, in vitro befruktning (IVF) og embryoproduksjon og overføring¹⁷. Så langt har hele denne prosessen bare blitt oppnådd hos mus¹⁸. Hos storfe er fremgangen mot follikkelvekst in vitro begrenset til noen få rapporter med variable follikkelstadier ved kulturstart, samt variabel kulturlengde mellom protokollene^17,19.

Metodene beskrevet i litteraturen for høsting av preantralfollikler fra bovin eggstokk har for det meste brukt mekaniske og enzymatiske teknikker, enten isolert eller i kombinasjon 2,14,17,20. Den første rapporten om en protokoll for bovin preantralfollikelisolasjon brukte en vevshomogenisator og seriell filtrering for å behandle hele eggstokkene²⁰. Denne studien ble fulgt av rapporter som kombinerer mekaniske og enzymatiske prosedyrer som benyttet kollagenase¹⁴. Et tilbakevendende tema ved bruk av kollagenase for å fordøye eggstokkvevet er den potensielle risikoen for skade på follikulær kjellermembran, noe som kan kompromittere follikkelens levedyktighet 14,21,22,23. Derfor har forskjellige kombinasjoner av mekaniske metoder blitt brukt, for eksempel bruk av en vevskrubber og gjentatt pipettering eller en vevskrubber kombinert med homogenisering 20,24,25,26. En annen mekanisk teknikk som er beskrevet, bruker nåler til å dissekere preantralfollikler direkte fra eggstokkvevet, noe som er spesielt nyttig for å isolere større (>200 μm) sekundære follikler. Imidlertid er denne prosessen tidkrevende, ineffektiv for å isolere mindre preantrale follikler, og er ferdighetsavhengig når den forsøkes i storfe^eggstokkene 19,27,28.

Ved å dra nytte av de forskjellige teknikkene som er beskrevet i litteraturen, hadde denne protokollen som mål å optimalisere isoleringen av preantralfollikler fra enkeltbovine eggstokkene på en enkel, konsistent og effektiv måte som unngår inkubasjon i enzymatiske løsninger. Forbedring av metodene for å isolere preantralfollikler vil gi en mulighet til å forbedre forståelsen av dette stadiet av follikulogenese og muliggjøre utvikling av effektive kultursystemer for å utvikle preantralfollikler til antralstadiet. De detaljerte prosedyrene som er beskrevet her for isolering av preantralfollikler fra et stort pattedyr som storfearten, vil være avgjørende for forskere som tar sikte på å studere tidlig follikulogenese hos en ikke-murinart som kan oversettes til mennesker.

Protocol

Bovine (Bos taurus) eggstokker ble hentet fra et lokalt slakteri og transportert til laboratoriet innen 6 timer etter samlingen. På grunn av det store antallet dyr som behandles i anlegget, er alderen, rasen og scenen i østrussyklusen til dyrene ukjente. Fordi ingen levende dyr ble brukt i disse forsøkene, var det ikke nødvendig med en godkjent dyrepleie- og bruksprotokoll. 1. Klargjøring av utstyr og reagenser Dekk en 2 fot bred del av en laboratoriebe…

Representative Results

Oversikt og kritiske trinnVed hjelp av denne protokollen kan små bovine preantralfollikler isoleres pålitelig fra enkle eggstokkene i eksperimentelt relevante tall. Fra totalt 30 replikasjoner ble det i gjennomsnitt oppnådd 41 follikler per replikasjon, med et område på 11 til 135 follikler (figur 4A). I 14 replikasjoner ble folliklene karakterisert for utviklingsstadium som tidligere beskrevet26 ved å måle follikeldiameteren ved hjelp av e…

Discussion

Den foreliggende protokollen beskriver en reproduserbar metode for å hente preantrale follikler i tidlig stadium, spesielt i primære og tidlige sekundære stadier, fra bovin eggstokk. Denne protokollen bygger på tidligere rapporter 20,25,30,34,35,36 og gir optimaliseringer som resulterer i isolering av et meningsfylt antall follikler fra en individuell eggstokk.^<…

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles