Ekstrahepatisk galdegang og galdeblæredissektion hos ni dage gamle musenyfødte
Summary
Til observation af murine neonatale galdekanalforstyrrelser kræves en intakt galdekanal og effektiv forberedelse. Derfor blev en ny tilgang til isolering af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem i murine nyfødte med succes udviklet, samtidig med at galdekanalens integritet blev opretholdt.
Abstract
Dissektionen af murine neonatale galdekanaler er blevet beskrevet som vanskelig. Hovedformålet med den beskrevne standardoperationsprocedure er isolering af den ekstrahepatiske galdekanal (EBD) hos musenyfødte uden at beskadige galdekanalen under forberedelsen. På grund af dets usædvanligt tætte forberedelse sammenlignet med cholangiocytcellelinjen og høst af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem (EBDS) er den beskrevne tilgang yderst nyttig til forskning i dyremodeller af nyfødte galdekanalforstyrrelser, såsom galdeatresi. Efter eutanasi blev peritonealhulen tilgået, og galdekanalsystemet, tolvfingertarmen og leveren blev ekstraheret med den unikke En-bloc-Resection (EbR). Den ekstraherede prøve placeres på en skummåtte, og EBD dissekeres fra forurenende celler atraumatisk uden nødvendig berøring. Dissektionen af hele EBDS er en væsentlig fordel ved denne metode. Der skal udvises forsigtighed på grund af den lille størrelse og mængde galdegangsvæv. Ved hjælp af den beskrevne teknik er der ingen skade på cholangiocytterne. Endvidere er renheden af teknikken reproducerbar (n = 10). Derfor kan optimalt sammenlignelige prøver høstes. Desuden er intet galdegangsvæv skadet, fordi enhver kontakt med galdekanalsystemet kan undgås under forberedelsen, hvilket efterlader galdevæsken inde i galdeblæren. Vigtigst af alt, mens de udførte den endelige galdeblære og galdekanaldissektion, blev atraumatiske mikroinstrumenter kun brugt lidt lateralt af galdekanalen uden at klemme den. Dette er nøglen til en ren og intakt prøve og afgørende for yderligere histologisk undersøgelse eller isolering af cholangiocytter. For at opsummere gør den beskrevne innovative dissektionsteknik det muligt for især uerfarne operatører med det nødvendige udstyr at isolere EBDS så rent som muligt.
Introduction
Tilblivelsen og progressionen af cholangiopatier såsom galde atresi, primær skleroserende cholangitis (PSC) og primær galdekolangitis (PBC) er enten ukendte eller ufuldstændige 1,2. Den begrænsede forståelse af disse sygdommes oprindelse og progression fører til mangel på behandlingsmuligheder3. Den sværeste hindring for at studere neonatale galdekanalforstyrrelser er at få en molekylær forståelse af patofysiologien. En af de væsentlige nøgler til en bedre forståelse af molekylær patologi er den bedst mulige observation af berørt væv. For at undgå reduceret sammenlignelighed og uoverensstemmelser mellem forskning, såsom observation af potentiel viral ætiologi af galde atresi4, opstår behovet for den bedst mulige forberedelse og deling af de udførte dissektionsteknikker. En ren forberedelse af målvævet er nødvendig for senere mikroskopiske undersøgelser eller avlscelle- og 3D-organoidkulturer. Men i murine neonatale lidelser er vævsprøver sjældne og forekommer kun i en lille mængde på grund af den meget lille størrelse. Med hensyn til galdegangsforstyrrelser er der beskrevet vanskeligheder med en ren tilberedning af galdekanaler hos murine nyfødte5. På grund af det neonatale udviklingsstadium er vævsdifferentiering ikke alt for avanceret, hvilket komplicerer forberedelsen og øger vanskeligheden sammenlignet med forberedelsen af voksne prøver. Derfor undersøgte driftsarbejdsgruppen en ny strategi for forberedelse af EBDS i en neonatal musemodel. I denne undersøgelse muliggør teknikken en effektiv dissektion af hver prøve.
Galdekanalsystemet er intraperitonealt placeret i højre øvre del af maven, der stammer fra leveren. Galdeblæren er placeret under den viscerale overflade af leverens højre lap. Galdekanalen er sammen med portalvenen og leverarterien indlejret i hepatoduodenalbåndet. Det forbinder leveren og tolvfingertarmen direkte og dræner galdevæske ind i tolvfingertarmen6. Anatomisk er galdekanalen opdelt i højre og venstre leverkanal, den fælles leverkanal, den cystiske kanal og Ductus choledochus, som dannes ved sammenløbet af den cystiske kanal og den fælles leverkanal7. Denne tømmer til sidst galdevæske og spyt fra bugspytkirtelkanalen ind i tolvfingertarmen via Vaters Ampulla.
Cholangiocytter beklæder galdekanalen intra- og ekstrahepatisk og bor i en kompliceret anatomisk niche, hvor de hjælper med galdeproduktion og homeostase8. Galdevæske passerer disse specialiserede epitelceller i høje koncentrationer dagligt. Især HCO3-paraplyvedligeholdelsen er meget vigtig for at beskytte mod galdesyretoksicitet9. Cholangiocytter er den første forsvarslinje i hepatobiliærsystemet mod for eksempel luminale mikroorganismer10. Cholangiocytternes forsvarseffektivitet mod giftige angreb kan svækkes af genetisk disposition. En giftig overbelastning forårsager skade og ødelæggelse og kan derfor føre til cholangiopatier. Desuden er den udviklende galdekanal ikke helt i stand til alle selvbeskyttende mekanismer, hvilket fører til en højere modtagelighed for miljøgifte i neonatale galdekanaler11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel rapporterede og diskuterede oprettelsen og valideringen af en ny kirurgisk tilgang til fjernelse af EBDS af aflivede neonatale mus. Mikroskopiske og histologiske fund afslører, at tilgangen hurtigt registrerer EBD’er og dissekerer dem nær kanalens margener, selv hos neonatale mus. Kun kirurgiske instrumenter og et mikroskop med en 20x forstørrelse er påkrævet for den beskrevne protokol. Desuden tillader tilgangen isolering af hele EBDS. Teknikken er meget effektiv, ligetil og enkel at replikere.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Hans Christian Schmidt blev støttet økonomisk af Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
