Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (<250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.
Les fibres de collagène I alignées (COL1) guident la motilité des cellules tumorales, influencent la morphologie des cellules endothéliales, contrôlent la différenciation des cellules souches et sont une caractéristique des tissus cardiaques et musculo-squelettiques. Pour étudier la réponse cellulaire aux microenvironnements alignés in vitro, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des matrices COL1 avec un alignement défini des fibres, y compris des méthodes magnétiques, mécaniques, cellulaires et microfluidiques. Parmi celles-ci, les approches microfluidiques offrent des capacités avancées telles que le contrôle précis des flux de fluides et du microenvironnement cellulaire. Cependant, les approches microfluidiques pour générer des matrices COL1 alignées pour les plateformes de culture in vitro avancées ont été limitées à de minces « tapis » (<40 μm d’épaisseur) de fibres de COL1 qui s’étendent sur des distances inférieures à 500 μm et ne sont pas propices aux applications de culture cellulaire 3D. Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des matrices COL1 3D (130-250 μm d’épaisseur) avec des régions millimétriques d’alignement de fibres définies dans un dispositif microfluidique. Cette plate-forme fournit des capacités avancées de culture cellulaire pour modéliser des microenvironnements tissulaires structurés en fournissant un accès direct à la matrice de micro-ingénierie pour la culture cellulaire.
Les cellules résident dans un réseau fibreux 3D complexe appelé matrice extracellulaire (ECM), dont la majeure partie est composée de la protéine structurelle collagène de type I (COL1)1,2. Les propriétés biophysiques de l’ECM fournissent des indices de guidage aux cellules et, en réponse, les cellules remodèlent la microarchitecture ECM 3,4,5. Ces interactions réciproques cellule-matrice peuvent donner naissance à des domaines fibreux COL1 alignés6 qui favorisent l’angiogenèse et l’invasion cellulaire dans l’environnement tumoral 7,8,9 et influencent la morphologie cellulaire 10,11,12, la polarisation 13 et la différenciation 14. Les fibres de collagène alignées favorisent également la cicatrisation des plaies 15, jouent un rôle clé dans le développement des tissus16 et contribuent à la communication cellulaire à longue distance17,18. Par conséquent, la réplication in vitro de la microarchitecture native de la fibre COL1 est une étape importante vers le développement de modèles structurés pour étudier les réponses cellulaires aux microenvironnements alignés.
Les systèmes de culture cellulaire microfluidique ont été établis comme une technologie privilégiée pour développer des systèmes microphysiologiques (MPS)19,20,21,22,23. Tirant parti des effets de mise à l’échelle microscopique favorables, ces systèmes fournissent un contrôle précis des écoulements de fluides, soutiennent l’introduction contrôlée de forces mécaniques et définissent le microenvironnement biochimique dans un microcanal 21,24,25,26,27. Les plateformes MPS ont été utilisées pour modéliser des microenvironnements spécifiques aux tissus et étudier les interactions multi-organes28. Simultanément, les hydrogels ont été largement explorés pour récapituler la mécanique 3D et l’influence biologique de l’ECM que l’on observe in vivo29,30. Avec un accent croissant sur l’intégration de la culture 3D avec des plates-formes microfluidiques, de nombreuses approches peuvent combiner des hydrogels COL1 dans des dispositifs microfluidiques31,32,33. Cependant, les méthodes d’alignement des hydrogels de COL1 dans les canaux microfluidiques ont été limitées à de minces « tapis » 2D (<40 μm d’épaisseur) dans des canaux de <1 mm de large, offrant un potentiel limité pour modéliser les réponses cellulaires dans des microenvironnements 3D alignés31,34,35,36.
Pour obtenir des hydrogels COL1 3D alignés dans un système microfluidique, il a été démontré que, lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée est exposée à des flux d’extension locaux (changement de vitesse le long de la direction du cours d’eau), les hydrogels COL1 résultants présentent un degré d’alignement des fibres directement proportionnel à l’ampleur de la vitesse de déformation d’extensionqu’ils subissent 37, 38. La conception du microcanal dans ce protocole est unique à deux égards ; premièrement, la conception segmentée introduit une contrainte d’extension locale à la solution COL1, et deuxièmement, sa construction en deux parties permet à l’utilisateur d’aligner les fibres COL1, puis de désassembler le canal pour accéder directement aux fibres alignées dans un format ouvert. Cette approche peut également être adoptée pour développer des plates-formes microfluidiques modulaires qui développent des systèmes microphysiologiques avec des matrices COL1 ordonnées. Le protocole suivant décrit le processus de fabrication de microcanaux segmentés et détaille l’utilisation des canaux pour aligner l’atelo COL1 bovin. Ce protocole fournit également des instructions pour la culture de cellules sur COL1 dans un format de puits ouvert et discute de l’ajout de fonctionnalités à la plate-forme à l’aide d’une couche de base modulaire et magnétique.
Les protocoles de génération de matrices COL1 avec des fibres alignées ont été décrits à l’aide de méthodes magnétiques, de l’application directe de contraintes mécaniques et de techniques microfluidiques47. Les approches microfluidiques sont couramment utilisées pour créer des systèmes microphysiologiques en raison de leurs caractéristiques d’écoulement et de transport bien définies, qui permettent un contrôle précis du microenvironnement biochimique. Étant donné que les…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par le National Institute of Health sous le numéro d’attribution R21GM143658 et par la National Science Foundation sous le numéro de subvention 2150798. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des organismes de financement.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |