Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio
Summary
Questo protocollo dimostra l’uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (<250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.
Abstract
Le fibre di collagene I allineato (COL1) guidano la motilità delle cellule tumorali, influenzano la morfologia delle cellule endoteliali, controllano la differenziazione delle cellule staminali e sono un segno distintivo dei tessuti cardiaci e muscoloscheletrici. Per studiare la risposta cellulare a microambienti allineati in vitro, sono stati sviluppati diversi protocolli per generare matrici COL1 con allineamento delle fibre definito, inclusi metodi magnetici, meccanici, cellulari e microfluidici. Di questi, gli approcci microfluidici offrono funzionalità avanzate come un controllo accurato dei flussi di fluidi e del microambiente cellulare. Tuttavia, gli approcci microfluidici per generare matrici COL1 allineate per piattaforme di coltura in vitro avanzate sono stati limitati a sottili “tappetini” (<40 μm di spessore) di fibre COL1 che si estendono su distanze inferiori a 500 μm e non sono favorevoli alle applicazioni di coltura cellulare 3D. Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare matrici 3D COL1 (130-250 μm di spessore) con regioni su scala millimetrica di allineamento delle fibre definito in un dispositivo microfluidico. Questa piattaforma fornisce funzionalità avanzate di coltura cellulare per modellare microambienti tissutali strutturati fornendo accesso diretto alla matrice microingegnerizzata per la coltura cellulare.
Introduction
Le cellule risiedono in una complessa rete fibrosa 3D chiamata matrice extracellulare (ECM), la maggior parte della quale è composta dalla proteina strutturale collagene di tipo I (COL1)1,2. Le proprietà biofisiche dell’ECM forniscono indicazioni alle cellule e, in risposta, le cellule rimodellano la microarchitettura ECM 3,4,5. Queste interazioni reciproche cellula-matrice possono dare origine a domini di fibre COL1 allineati6 che promuovono l’angiogenesi e l’invasione cellulare nell’ambiente tumorale 7,8,9 e influenzano la morfologia cellulare 10,11,12, la polarizzazione 13 e la differenziazione 14. Le fibre di collagene allineate promuovono anche la guarigione delle ferite15, svolgono un ruolo chiave nello sviluppo dei tessuti 16 e contribuiscono alla comunicazione cellulare a lungo raggio17,18. Pertanto, replicare la microarchitettura nativa della fibra COL1 in vitro è un passo importante verso lo sviluppo di modelli strutturati per studiare le risposte cellulari a microambienti allineati.
I sistemi di coltura cellulare microfluidica sono stati stabiliti come tecnologia preferita per sviluppare sistemi microfisiologici (MPS)19,20,21,22,23. Sfruttando effetti di ridimensionamento su microscala favorevoli, questi sistemi forniscono un controllo preciso sui flussi di fluidi, supportano l’introduzione controllata di forze meccaniche e definiscono il microambiente biochimico all’interno di un microcanale 21,24,25,26,27. Le piattaforme MPS sono state utilizzate per modellare microambienti tessuto-specifici e studiare le interazioni multiorgano28. Allo stesso tempo, gli idrogel sono stati ampiamente esplorati per ricapitolare la meccanica 3D e l’influenza biologica della ECM che si osservano in vivo29,30. Con una crescente enfasi sull’integrazione della coltura 3D con piattaforme microfluidiche, numerosi approcci possono combinare idrogel COL1 in dispositivi microfluidici31,32,33. Tuttavia, i metodi per allineare gli idrogel COL1 nei canali microfluidici sono stati limitati a sottili “tappetini” 2D (<40 μm di spessore) in canali larghi <1 mm, offrendo un potenziale limitato per modellare le risposte cellulari in microambienti 3D allineati31,34,35,36.
Per ottenere idrogel COL1 3D allineati in un sistema microfluidico, è stato dimostrato che, quando una soluzione COL1 autoassemblante è esposta a flussi estensionali locali (variazione di velocità lungo la direzione del flusso), gli idrogel COL1 risultanti mostrano un grado di allineamento delle fibre che è direttamente proporzionale all’entità della velocità di deformazione estensionale che sperimentano37, 38. Il design a microcanali in questo protocollo è unico in due modi; in primo luogo, il design segmentato introduce la deformazione estensionale locale nella soluzione COL1 e, in secondo luogo, la sua costruzione “a due pezzi” consente all’utente di allineare le fibre COL1 e quindi smontare il canale per accedere direttamente alle fibre allineate in un formato aperto. Questo approccio può essere ulteriormente adottato per sviluppare piattaforme microfluidiche modulari che sviluppano sistemi microfisiologici con matrici COL1 ordinate. Il seguente protocollo descrive il processo di fabbricazione di microcanali segmentati e descrive in dettaglio l’uso dei canali per allineare l’atelo bovino COL1. Questo protocollo fornisce anche istruzioni per la coltura di cellule su COL1 in un formato a pozzo aperto e discute l’aggiunta di funzionalità alla piattaforma utilizzando uno strato di base magnetico modulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli per generare matrici COL1 con fibre allineate sono stati descritti utilizzando metodi magnetici, l’applicazione diretta di deformazioni meccaniche e tecniche microfluidiche47. Gli approcci microfluidici sono comunemente usati per creare sistemi microfisiologici a causa delle loro caratteristiche di flusso e trasporto ben definite, che consentono un controllo preciso sul microambiente biochimico. Poiché le fibre COL1 allineate forniscono segnali istruttivi chiave durante i processi fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health con il numero di premio R21GM143658 e dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzione 2150798. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale delle agenzie di finanziamento.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
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