Her beskriver vi metoden for å etablere en trippelcellekulturmodell av blod-hjernebarrieren basert på primære humane hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne flercellede modellen er egnet for studier av dysfunksjon i nevrovaskulære enheter under iskemisk hjerneslag in vitro eller for screening av legemiddelkandidater.
Iskemisk hjerneslag er en viktig årsak til død og uførhet over hele verden med begrensede terapeutiske muligheter. Nevropatologien til iskemisk slag er preget av et avbrudd i blodtilførselen til hjernen som fører til celledød og kognitiv dysfunksjon. Under og etter iskemisk hjerneslag letter blod-hjernebarriere (BBB) dysfunksjon skadeprogresjon og bidrar til dårlig pasientgjenoppretting. Nåværende BBB-modeller inkluderer primært endotelmonokulturer og doble samkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Slike modeller mangler evnen til å etterligne et dynamisk hjernemikromiljø, noe som er avgjørende for celle-til-celle-kommunikasjon. I tillegg inneholder ofte brukte BBB-modeller ofte udødelige humane endotelceller eller dyreavledede (gnagere, svin eller storfe) cellekulturer som utgjør translasjonelle begrensninger. Dette papiret beskriver en ny brønninnsatsbasert BBB-modell som bare inneholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter) som muliggjør undersøkelse av iskemisk hjerneskade in vitro.
Effektene av oksygen-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet ble vurdert ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk motstand (TEER) målinger og direkte visualisering av hypoksiske celler. Den presenterte protokollen gir en klar fordel ved å etterligne det intercellulære miljøet til BBB in vivo, og fungerer som en mer realistisk in vitro BBB-modell for å utvikle nye terapeutiske strategier i innstillingen av iskemisk hjerneskade.
Hjerneslag er en av de viktigste årsakene til død og langsiktig uførhet over hele verden1. Forekomsten av hjerneslag øker raskt med alderen, og dobles hvert 10. år etter fylte 55år. Iskemisk hjerneslag oppstår som følge av cerebral blodstrømforstyrrelse på grunn av trombotiske og emboliske hendelser, som omfatter mer enn 80% av alle slagtilfeller3. Selv nå er det relativt få behandlingsalternativer tilgjengelig for å minimere vevsdød etter iskemisk slag. Behandlingene som finnes er tidssensitive og fører følgelig ikke alltid til gode kliniske resultater. Derfor er det behov for forskning på komplekse cellulære mekanismer for iskemisk slag som påvirker poststroke-utvinning.
BBB er et dynamisk grensesnitt for utveksling av molekyler mellom blodet og hjernen parenchyma. Strukturelt består BBB av hjernemikrovaskulære endotelceller sammenkoblet av krysskomplekser omgitt av en kjellermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av BBB-integritet gjennom sekresjon av ulike faktorer som er nødvendige for dannelsen av sterke, tette kryss 5,6. Fordelingen av BBB er et av kjennetegnene ved iskemisk slag. Akutt inflammatorisk respons og oksidativt stress assosiert med cerebral iskemi resulterer i forstyrrelse av tette kryssproteinkomplekser og dysregulert krysstale mellom astrocytter, pericytter og endotelceller, noe som fører til økt paracellulær løsemiddelpermeabilitet over BBB7. BBB-dysfunksjon fremmer videre dannelsen av hjerneødem og øker risikoen for hemorragisk transformasjon8. Tatt i betraktning alt ovenfor, er det stor interesse for å forstå de molekylære og cellulære endringene som oppstår på BBB-nivå under og etter iskemisk slag.
Selv om mange in vitro BBB-modeller har blitt utviklet de siste tiårene og brukt i en rekke studier, kan ingen av dem fullt ut replikere in vivo-forhold 9. Mens noen modeller er basert på endotelcellemonolag dyrket på godt innsatte permeable støtter alene eller i kombinasjon med pericytter eller astrocytter, har bare nyere studier introdusert trippelcellekulturmodelldesign. Nesten alle eksisterende trippelkultur BBB-modeller inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isolert fra dyrearter eller celler avledet fra humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
Ved å erkjenne behovet for å bedre rekapitulere den humane BBB in vitro, etablerte vi en trippelcellekultur in vitro BBB-modell sammensatt av humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære vaskulære pericytter i humanhjernen (HBVP). Denne trippelkulturen BBB-modellen er satt opp på 6-brønns plate, polyestermembraninnsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brønninnsatsene gir et optimalt miljø for cellefeste og gir enkel tilgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rom for middels prøvetaking eller sammensatt applikasjon. Funksjonene i denne foreslåtte trippelcellekultur BBB-modellen vurderes ved å måle TEER og paracellulær fluks etter OGD som etterligner iskemisk slag in vitro, med mangel på oksygen (<1% O2) og næringsstoffer (ved bruk av glukosefritt medium) oppnådd ved bruk av et fuktet, forseglet kammer. I tillegg er induserte iskemisklignende forhold i denne modellen nøyaktig verifisert ved direkte visualisering av hypoksiske celler.
I denne protokollen beskriver vi en metode for å sette opp en pålitelig trippel endotelcelle-pericytt-astrocyttkultur BBB-modell for å studere BBB-dysfunksjon i innstillingen av iskemisk hjerneslag in vitro. Med tanke på at pericytter er de nærmeste naboene til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden av brønninnsatsene i denne modellen16. Selv om denne konfigurasjonen mangler direkte celle-til-celle-kommunikasjon mellom astrocytter og endotelceller, tillater de…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |