neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
인체는 인간 세포로 구성된 미생물 세포와 적어도 동일한 수의 미생물 세포에 의해 군집화되어 있으며, 이러한 미생물의 대부분은 장에 있습니다. 장내 마이크로바이옴과 숙주 사이의 상호 작용은 광범위하게 연구되어 왔지만, 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 상호 작용하는지는 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 현재까지 장내 마이크로바이옴-신경계 상호작용을 연구하기 위한 생리학적으로 대표적인 체외 모델은 존재하지 않습니다.
이 간극을 메우기 위해 유도만능줄기세포 유래 장 뉴런을 장치에 도입하여 인간-미생물 누화(HuMiX) gut-on-chip 모델을 추가로 개발했습니다. 그 결과 ‘neuroHuMiX’라는 모델을 통해 반투과성 막으로 분리된 미세유체 채널을 통해 박테리아, 상피 및 신경 세포를 공동 배양할 수 있습니다. 서로 다른 세포 유형의 분리에도 불구하고 세포는 용해성 인자를 통해 서로 통신할 수 있으며 동시에 각 세포 유형을 개별적으로 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 설정을 통해 장내 마이크로바이옴이 장 신경 세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 첫 번째 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이는 인간의 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하고 이해하는 데 있어 중요한 첫 번째 단계입니다.
인간의 장내 마이크로바이옴은 인간의 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 지난 10년 반 동안 광범위하게 연구되어 왔으며, 건강과 질병을 조절하는 잠재적인 역할이 이제 확립되었습니다1. 불균형한 미생물 군집(dysbiosis)으로 이어지는 마이크로바이옴의 교란은 비만, 염증성 장 질환, 대장암과 같은 많은 만성 질환 또는 파킨슨병과 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 관여하는 것으로 추정되었습니다 2,3.
인간의 장내 마이크로바이옴은 신경학적 상태와 관련이 있지만, 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 소통하고 영향을 미치는지는 아직 명확하지 않습니다. 인간의 장 신경계는 즉각적인 연구가 쉽지 않기 때문에 지금까지 동물 모델을 실험에 사용했습니다4. 그러나, 동물 모델과 인간 5 사이의 명백한 차이점을 감안할 때, 인간의 장을 모방한 시험관 내 모델의 개발은 즉각적인 관심의 대상이다. 이러한 맥락에서 인간 유도만능줄기세포(iPSC)의 급성장하고 발전하는 분야는 대표적인 장 뉴런(EN)6을 얻을 수 있게 해주었습니다. iPSC 유래 EN을 사용하면 세포 배양 삽입물, 오가노이드 또는 장기 칩(organs-on-a-chip)과 같은 체외 배양 모델에서 장 신경계를 연구할 수 있습니다 7,8.
인간-미생물 누화(HuMiX) 모델은 인간의 장을 모방한 gut-on-a-chip 모델이다9. 초기 HuMiX 모델(이하 초기 장치라고 함)은 상피 세포(Caco-2) 및 박테리아 세포(10,11)를 수용했습니다. 그러나 장내 마이크로바이옴-신경계 연관성을 연구하기 위해 iPSC 유래ENs 6도 시스템에 도입되었습니다(그림 1). 신경 세포, 상피 세포 및 박테리아 세포의 근위 공동 배양을 통해 다양한 세포 유형을 개별적으로 분석하고 인간 장과 유사한 환경에서 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)(예: gut-on-a-chip) 모델을 사용하여 보다 생리학적으로 대표적인 방식으로 장기를 연구하기 위한 모델 개발이 이루어졌습니다. 이러한 모델은 지속적인 영양소 공급 및 노폐물 제거뿐만 아니라 산소 수준 또는 장벽 무결성 8,12의 실시간 모니터링으로 인해 인간의 장내 환경을 더 잘 나타냅니다. 이러한 모델은 특히 장내 세균이 숙주 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 그러나 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 상호 관계를 연구하기 위해 장기 칩을 사용할 수 있으려면 신경 세포가 이러한 시스템에 통합되어야 합니다. 따라서 HuMiX를 더욱 발전시키고 neuroHuMiX 시스템(이하 장치)을 구축하기 위한 목적은 장 신경 세포를 장 상피 세포 및 박테리아와 근위 공동 배양하는 것을 포함하는 gut-on-a-chip 모델을 개발하는 것이었습니다.
인간의 장내 마이크로바이옴이 숙주의 건강과 질병에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 특히 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경 질환에서 마이크로바이옴의 중요성을 시사하는 지식에도 불구하고3,13 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 상호 작용하는지, 그리고 더 나아가 뇌와 어떻게 상호 작용하는지는 거의 알려져 있지 않습니다.
장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 상호작용을 연구하는 대표적인 모델은 지금까지 발견되지 않았습니다. 장-뇌 축(gut-brain axis)에 관한 연구는 전통적으로 쥐 모델(murine model)을 사용하여 수행되어 왔다13. 생쥐와 인간은 게놈 염기서열의 85%를 공유하지만14, 생쥐와 인간을 비교할 때 고려해야 할 중요한 차이점이 있다. 장과 관련하여 인간에 비해 쥐는 독점적으로 초식 동물이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그 결과, 위장관의 길이와 특징이 다르는데, 예를 들어 ‘위 배출'(gastric emptying)이 그것이다.14 쥐의 뇌는 또한 쥐와 인간의 전체적인 구조가 다르다는 중요한 차이점을 보여준다15. 중요한 것은, 인간은 신경 전구 세포의 세포주기 시간이 더 길다는 것이다15. 따라서 장 및 신경 세포를 포함한 인간 유래 세포를 포함하는 대표 모델을 개발하는 것이 중요하다5. 이러한 맥락에서 시험관 모델을 통해 보다 재현성 있는 연구를 개발하면 동물 모델을 사용할 필요성이 줄어들고 재현성이 향상됩니다.
neuroHuMiX는 이전 HuMiX 모델9의 고급 버전입니다. HuMiX는 상피 세포와 박테리아 세포의 근접 및 대표 공동 배양을 가능하게 하는 gut-on-a-chip 모델입니다. 세포 간 통신은 반투과성 막을 통한 분비 인자 및 대사 산물의 근위 공동 배양 및 확산을 통해 가능합니다. 그러나 인간의 장내 환경을 연구하기 위한 초기 장치의 유용성을 확장하기 위해서는 추가적인 세포 유형의 도입이 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 iPSC 유래 EN의 도입으로 개발된 neuroHuMiX는 박테리아, 장 상피 세포 및 EN의 근위 공동 배양을 가능하게 합니다. 그 결과로 나온 체외 모델을 통해 인간 신경계와 관련된 인간 장내 마이크로바이옴에 관한 질문을 해결할 수 있습니다. 서로 다른 세포 유형, 특히 포유류 세포와 박테리아의 공동 배양은 생존력 손실, 접착력 저하 및 합류16의 전반적인 손실을 포함하여 몇 가지 문제가 있습니다. 여기에서 우리는 이 장치 내에서 세포 생존율을 높게 유지하면서 동일한 시스템 내에서 세 가지 다른 세포 유형을 공동 배양할 수 있음을 입증했습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 장치에 접종하기 전에 신경 세포의 밀도(80%-90% 세포 밀도 및 생존율)를 보장하는 것입니다. 실행 중에는 세포 성장을 평가할 수 없기 때문에 모델에 세포를 도입하기 전에 세포가 합류하고 잘 성장하는지 확인하는 것이 가장 중요합니다. 이것이 제한 요인이 될 수 있지만 장치 내에서 관찰되는 전반적인 생존 가능성과 밀도는 일반적으로 높습니다.
이 장치는 튜브 라인을 통해 연동 펌프에 연결됩니다. 각 셀 챔버에는 특정 튜빙 라인이 있습니다. 튜빙은 매체의 관류를 위해 연동 펌프를 사용할 수 있는 펌프 튜빙과 펌프 튜빙을 장치에 연결하는 튜빙 및 장치를 유출/폐기물 병에 연결하는 튜빙으로 구성됩니다. 샘플링 포트는 유출 매체의 접종 및 샘플링을 허용하기 위해 장치 전후에 포함됩니다. 각 챔버는 서로 다른 배지에 연결할 수 있어 각 개별 세포 유형에 가장 적합한 배양 조건을 제공할 수 있습니다. 각 챔버는 매체 공급에 대한 특정 요구 사항에 따라 열거나 닫을 수 있습니다. 이 장치에서 신경 챔버는 대부분의 실험 동안 닫힌 상태로 유지되는 반면 박테리아 및 상피 챔버는 항상 열려 있어 전체 실험 실행 동안 신선한 배지를 얻습니다. 매체가 중단 없이 흐르도록 하려면 튜브, 커넥터 또는 장치에 공기가 남아 있지 않도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 먼저 프라이밍 단계에서 장치를 몇 분 동안 실행하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 문제가 해결되는 경우가 많습니다. 그렇지 않은 경우 유출의 3방향 스톱콕을 닫아 떨어지는 다른 라인 중 하나를 짧은 시간 동안 닫을 수 있습니다. 이렇게 하면 매체가 기포가 있는 라인으로 리디렉션되어 튜브를 통해 기포를 바깥쪽으로 밀어 문제를 해결합니다.
모든 세포 배양 실험에서 배지는 각 세포 유형마다 해당 배지가 있는 핵심 구성 요소입니다. 공동 배양 설정에서 배지는 배지에서 자라는 세포 유형뿐만 아니라 공동 배양 내의 다른 세포 유형과도 호환되어야 합니다. 이것은 장치에서도 다르지 않으며, 내부에 박테리아, 상피 및 신경 세포의 세 가지 다른 세포 유형이 있는 세 개의 다른 구획이 있기 때문에 추가적인 문제를 제기합니다. 그러나 우리는 10% FBS가 있는 RPMI 1640에 5% MRS를 추가하여 박테리아 배지를 변형시킴으로써 모든 세포 유형, 특히 박테리아 및 상피 세포가 시스템 내에서 성공적으로 공동 배양될 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 장치에서는 서로 다른 세포 유형이 근접하여 공동 배양되므로 서로 직접 접촉하지 않습니다. 이것이 인간 장에서 세포 간의 직접적인 접촉을 완전히 대표하지 못하여 한계가 있지만, 근위부 및 대표성 공동 배양 조건은 다운스트림 분석에 강점이 됩니다. 용해성 인자는 서로 다른 챔버와 세포 유형 사이에서 교환됩니다. 따라서 세포는 여전히 서로 상호 작용하고 있습니다. 또한 세포 유형을 개별적으로 채취하고 분석할 수 있다는 사실을 통해 다양한 세포 유형(신경 세포 포함)에 대한 건강한 및/또는 질병 마이크로바이옴의 영향을 연구하여 세포 유형별 판독값을 결정/검색할 수 있습니다. 또 다른 한계는 각 실험이 끝날 때만 장치를 열고 세포를 확인할 수 있기 때문에 실험 실행 중에 세포의 형태를 추적할 수 없다는 것입니다.
우리가 아는 한, neuroHuMiX는 EN을 포함한 최초의 gut-on-a-chip 모델입니다. 이는 장내 미생물군과 장 신경계 사이의 통신을 밝히기 위한 단계입니다. 박테리아 종, 상피층 및 EN 간의 상호 작용을 조사할 수 있는 모델입니다. 그 설계를 통해 서로 다른 세포 유형에 의해 분비되는 용해성 인자의 교환과 서로에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 앞으로는 iPSC 유래 EN뿐만 아니라 iPSC 유래 상피 세포를 장치 내부에 두어 장치를 개인화된 모델로 전환하는 것이 중요할 것입니다. 중요한 것은, 이 개인화된 모델은 프리바이오틱스(pre-biotics), 프로바이오틱스(pro-), 그리고 신바이오틱스(synbiotics)10,11를 테스트하고 잠재적으로 개인화된 스크리닝 및 치료적 접근법을 개발하기 위해 사용될 수 있다는 것이다 17. 개인화된 neuroHuMiX는 궁극적으로 인간 장내 마이크로바이옴의 ‘암흑 물질’과 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 따라 신경계와의 상호 작용을 밝혀 치료 평가 및 개입을 위한 길을 열 수 있습니다.
우리는 장 신경계를 포함한 gut-on-a-chip을 가질 수 있다는 것이 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 따른 상호 작용에 대한 연구와 이해를 진전시키는 데 중요하다는 결론을 내릴 수 있습니다. NeuroHuMiX를 사용하면 박테리아 종이 숙주 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있으며 생리학적으로 훨씬 더 대표적인 방식으로 모델을 더욱 개선할 수 있는 좋은 기반을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자들은 K7 계열의 세포를 제공해준 Jared Sterneckert 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 엔지니어링 측면에 도움을 준 애리조나 대학의 오랜 협력자인 Frederic Zenhausern 박사와 Matthew W. Barret 박사에게도 감사의 뜻을 전합니다. 또한 neuroHuMiX의 개략적인 표현을 설계하는 데 도움을 주신 Valentina Galata 박사님께도 감사드립니다. 이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 계약 863664)에 따라 유럽 연구 위원회(ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. 그림 1 은 부분적으로 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다.
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |