रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम गतिविधि पहचान परख का उपयोग करके टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि के संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विधि शुद्ध घटकों या सेल / ऊतक अर्क से टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने से जुड़े किसी भी क्षेत्र में व्यापक अनुप्रयोग हैं।
न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन की मात्रा या अन्य प्रासंगिक अणुओं का पता लगाने के लिए रोलिंग सर्कल प्रवर्धन जैसी इज़ोटेर्मल प्रवर्धन-आधारित तकनीकों को सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। इन विधियों ने नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए पीसीआर या एलिसा के पर्याप्त विकल्प दिखाए हैं। इसके अलावा, प्रोटीन की मात्रा का पता लगाना (पश्चिमी धब्बा या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा) अक्सर कैंसर निदान के लिए जानकारी प्रदान करने के लिए अपर्याप्त होता है, जबकि एंजाइम गतिविधि का माप एक मूल्यवान बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व करता है। एंजाइम गतिविधि का माप रोगज़नक़ जनित रोगों के निदान और संभावित उपचार के लिए भी अनुमति देता है। सभी यूकेरियोट्स में, टोपोइसोमेरेस महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान डीएनए टोपोलॉजिकल स्थिति के नियंत्रण में शामिल प्रमुख डीएनए-बाध्यकारी एंजाइम हैं और कैंसर के पूर्वानुमान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण बायोमाकर्स में से हैं।
वर्षों से, टोपोइसोमेरेस को प्राकृतिक और सिंथेटिक छोटे-अणु यौगिकों के पुस्तकालयों के साथ एंटीपैरासिटिक और एंटीकैंसर दवाओं के संभावित लक्ष्य के रूप में काफी हद तक जांच की गई है जिनकी हर साल जांच की जाती है। यहां, रोलिंग सर्कल प्रवर्धन विधि, जिसे रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम एक्टिविटी डिटेक्शन (आरईईएडी) परख कहा जाता है जो एक सरल, तेज और जेल-मुक्त तरीके से टोपोइसोमेरेस 1 (टीओपी 1) गतिविधि के मात्रात्मक माप की अनुमति देता है। एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए डीएनए सब्सट्रेट को छोड़कर और लिगेट करके, टीओपी 1 एक डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को एक बंद सर्कल में परिवर्तित करता है, जो रोलिंग सर्कल प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट बन जाता है, जिससे ~ 103 टेंडम रिपीट रोलिंग सर्कल उत्पाद उत्पन्न होते हैं। प्रवर्धन के दौरान न्यूक्लियोटाइड निगमन के आधार पर, प्रतिदीप्ति से केमिल्यूमिनेसेंस से कलरमेट्रिक तक विभिन्न रीडआउट विधियों की संभावना है। चूंकि प्रत्येक टीओपी 1-मध्यस्थता दरार-बंधाव एक बंद डीएनए सर्कल उत्पन्न करता है, परख अत्यधिक संवेदनशील और सीधे मात्रात्मक है।
टोपोइसोमेरेस डीएनए-संशोधित एंजाइमों के वर्ग से संबंधित हैं और इनमें से कई मानव रोगों 1,2,3,4,5,6 के लिए बायोमार्कर के रूप में उपयोगी साबित हुए हैं। टीओपी 1 सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे डीएनए प्रतिकृति, जीन प्रतिलेखन, पुनर्संयोजन और क्रोमोसोमल अलगाव 7 से जुड़े टोपोलॉजिकल तनाव को हल करने में शामिलहै। टीओपी 1 एक तंत्र द्वारा नकारात्मक और सकारात्मक सुपरकॉइल दोनों को हल कर सकता है जिसमें डीएनए 8,9 में क्षणिक एकल-फंसे हुए ब्रेक का गठन शामिल है। डीएनए से जुड़ने के बाद, टीओपी 1 सक्रिय साइट टायरोसिन (टायर 723) को फॉस्फोडिएस्टर रीढ़ की हड्डी पर न्यूक्लियोफिलिक हमला करने के लिए रखता है। एक टीओपी 1-डीएनए क्लीवेज कॉम्प्लेक्स तब एंजाइम सहसंयोजक रूप से टूटे हुए डीएनए स्ट्रैंड के 3′-अंत से जुड़ा होता है। यह क्लीवर स्ट्रैंड के 5′-एंड को बरकरार स्ट्रैंड के चारों ओर घूमने की अनुमति देकर टोरसनल तनाव को जारी करता है। अंत में, 5′-एंड का हाइड्रॉक्सिल समूह 3′-फॉस्फोटायरोसिल बॉन्ड पर न्यूक्लियोफिलिक हमला करता है। नतीजतन, टीओपी 1 जारी किया जाता है, और डीएनए बैकबोनको बहाल किया जाता है।
टॉप 1 उत्प्रेरक चक्र के चरणों की जांच करने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं, जिनमें विश्राम परख10, इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए) 11,12, डीएनए आत्महत्या दरार-बंधाव परख13,14, और एंजाइमों के विवो कॉम्प्लेक्स (आईसीई) परख15 शामिल हैं। . हालांकि, इन परखों की कई सीमाएं हैं क्योंकि वे जेल वैद्युतकणसंचलन पर निर्भर हैं, जिसके लिए डीएनए इंटरकैलेटिंग एजेंटों की आवश्यकता होती है, या उन्हें अत्यधिक विशिष्ट प्रशिक्षण और उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, परख को बेहतर प्रदर्शन करने के लिए बड़ी मात्रा में शुद्ध टीओपी 1 एंजाइम (विश्राम परख के लिए 1 से 5 एनजी और ईएमएसए और क्लीवेज-लिगेशन परख के लिए 50 से 200 एनजी तक) या कम से कम 106 कोशिकाओं से अर्क की आवश्यकता होती है। इसलिए, एक अत्यधिक संवेदनशील विधि जो कच्चे जैविक नमूनों में और एकल उत्प्रेरक घटना स्तर पर टीओपी 1 गतिविधि का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाती है, जिसे आरईईएडी परख कहा जाता है, विकसितकिया गया है।
यहां, आरईईएडी परख16 का उपयोग करके टीओपी 1 गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। परख का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दर्शाया गया है। एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया सिलिकॉन ग्रिड ग्लास-स्लाइड मल्टीवेल सेटअप बनाने के लिए एक कार्यात्मक स्लाइड से जुड़ा हुआ है, जिसे निम्नलिखित में वेलमेकर कहा जाता है (चित्रा 1 ए)। इसके बाद स्लाइड के कुओं में कार्यात्मक एनएचएस समूहों के लिए 5′-एमिनो संशोधित प्राइमर का युग्मन होता है (चित्रा 1 बी)। टीओपी 1-मध्यस्थता दरार और बंधाव प्रतिक्रिया एक विशिष्ट डीएनए सब्सट्रेट को एक बंद सर्कल में परिवर्तित करती है। टॉप 1-विशिष्ट सब्सट्रेट (चित्रा 1 सी) अनायास एक डंबल-आकार में फोल्ड हो जाता है जिसमें एक डबल-फंसे हुए स्टेम और दो एकल-फंसे हुए लूप होते हैं। लूप में से एक सतह-लंगर प्राइमर का पूरक है। स्टेम क्षेत्र में एक पसंदीदा टीओपी 1 दरार साइट होती है जो 3′-एंड और 5′-हाइड्रॉक्सिल ओवरहैंग से ऊपर की ओर तीन आधार होती है। सब्सट्रेट का परिपत्रीकरण या तो सेल / ऊतक अर्क (चित्रा 1 सी) या पुनः संयोजक, शुद्ध टीओपी 1 (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
जब सब्सट्रेट को टीओपी 1 द्वारा छोड़ दिया जाता है, तो एंजाइम क्षणिक रूप से 3′-अंत से बंध जाता है और तीन-बेस टुकड़ा फैल जाता है, जिससे 5′-ओवरहैंग सब्सट्रेट को नष्ट करने और टीओपी 1-मध्यस्थता बंधाव की सुविधा प्रदान करता है। बंधाव के परिणामस्वरूप सब्सट्रेट का परिपत्रीकरण होता है और बाद में टीओपी 1 का पृथक्करण होता है। बंद सर्कल को सतह-लंगर वाले प्राइमर (चित्रा 1 ई) में संकरित किया जाता है और इसका उपयोग फी 29 पोलीमरेज़ द्वारा मध्यस्थता में इज़ोटेर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है, जो स्ट्रैंड विस्थापन के साथ आरसीए कर सकता है, जिससे 103 अग्रानुक्रम दोहराव उत्पाद उत्पन्न होते हैं। आरसीए चरण के दौरान, फ्लोरोसेंटली लेबल (चित्रा 1 एफ) या बायोटिन-युग्मित (चित्रा 1 जी) न्यूक्लियोटाइड को 17 शामिल किया जा सकताहै। फ्लोरोसेंटली लेबल न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश या तो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लोरेसेंस स्कैनर का उपयोग करके आरसीपी का पता लगाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, एक हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी)-युग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी (चित्रा 1 एच) बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड्स को बांध सकता है, इस प्रकार या तो एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) का उपयोग करके या 3,3′, 5,5′-टेट्रामिथाइलबेंजिडीन (टीएमबी) के एक पता लगाने योग्य रंग में रूपांतरण करके रोल्ड सर्कल उत्पादों (आरसीपी) का पता लगाने की अनुमति देता है। आरसीए एक रैखिक प्रतिक्रिया गतिज का अनुसरण करता है, जिससे आरईईएडी परख सीधे मात्रात्मक हो जाती है, क्योंकि एक आरसीपी एकल टीओपी 1-मध्यस्थता दरार-बंधाव प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। यहां यह दिखाया गया है कि इस परख का उपयोग टीओपी 1 गतिविधि को शुद्ध पुनः संयोजक एंजाइम के रूप में या कच्चे नमूनों से निकाला जा सकता है और एंटी-टॉप 1 ड्रग्स स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जा सकता है।
टोपोइसोमेरेस डीएनए-संशोधित एंजाइमों के एक वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं जो उच्च अनुसंधान और नैदानिक रुचि को आकर्षित करते हैं, एंटीकैंसर उपचार में या संक्रामक रोगों की लड़ाई में संभावित प्रभाव के साथ छोटे-अणु यौगिकों का लक्ष्य होता है। इसके अलावा, मानव टीओपी 1 की गतिविधि कैंसर के पूर्वानुमान और उपचार 18,19,23 का एक प्रभावी बायोमार्कर साबित हुई है। यद्यपि यह टीओपी 1 गतिविधि है जो कीमोथेरेपी अवरोधक26 की प्रभावकारिता को प्रभावित करती है, यह अक्सर डीएनए-आरएनए की मात्रा या टीओपी 1 की मात्रा है जिसका नैदानिक सेटिंग्स में मूल्यांकन किया जाता है। यह तेज़, आसान और जेल-आधारित मुक्त उपकरणों की कमी के कारण है जो हर प्रयोगशाला सेटिंग्स में टोपोइसोमेरेस गतिविधि का सटीक और सटीक परिमाणीकरण प्रदान कर सकते हैं।
यहां, आरईईएडी परख के लिए एक प्रोटोकॉल जो जेल-मुक्त तरीके से टीओपी 1 गतिविधि के माप की अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं से शुद्ध टीओपी 1 या कच्चे अर्क को एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए डीएनए डंबल के आकार के सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जो टीओपी 1 द्वारा मध्यस्थता में दरार / बंधाव पर एक बंद, गोलाकार अणु में परिवर्तित हो जाता है। फिर मंडलों को कांच की सतह पर संकरित किया जाता है और आरसीए द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। स्लाइड पर होने वाली प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन में उपयोग में आसानी की अनुमति देने के लिए, ग्लास से एक सिलिकॉन ग्रिड जुड़ा हुआ है, जिससे अलग-अलग कुएं बनते हैं जहां प्रतिक्रियाएं होती हैं। इस तरह, प्रोटोकॉल एक मल्टीवेल सिस्टम का लाभ उठाता है- एक सिलिकॉन ग्रिड-जिसे वेलमेकर कहा जाता है।
प्रोटोकॉल का उपयोग कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं कैको 2 से निकाले गए पुनः संयोजक टीओपी 1 और टीओपी 1 की गतिविधि का पता लगाने के लिए किया गया था, जिसका उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था। इसके अलावा, दवा स्क्रीनिंग टूल के रूप में उपयोग किए जाने वाले आरईईएडी के एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल का उपयोग प्रसिद्ध टीओपी 1 अवरोधक सीपीटी24,25 द्वारा टीओपी 1 गतिविधि अवरोध का पता लगाने के लिए किया गया था। परख को विभिन्न रीडआउट विधियों-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा गया था, जो एक उच्च संवेदनशीलता देता है, और एक फ्लोरेसेंस स्कैनर, केमिल्यूमिनेसेंस, या कलरमेट्रिक, जिसके लिए कम विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप रीडआउट में अच्छी गुणवत्ता वाले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेटिंग, कुशल कर्मियों और समय लेने वाली छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की आवश्यकता की सीमाएं हैं।
इन कारणों से, प्रतिदीप्ति स्कैनर रीडआउट जो संवेदनशीलता की कीमत पर भी तेजी से अधिग्रहण और विश्लेषण की अनुमति देता है। फ्लोरेसेंस स्कैनर की कमी के मामले में, दो उत्कृष्ट विकल्प, केमिलुमिनेसेंस और कलरमेट्रिक रीडआउट विधियों पर विचार किया जा सकता है। दोनों विधियां तेज और सरल हैं, जिन्हें किसी महंगे उपकरण या विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। सभी रीडआउट प्रारूपों में, आरईईएडी के पास अत्याधुनिक परखों की तुलना में कई फायदे हैं, जो अधिक समय लेने वाले, जेल-आधारित (इंटरकैलेटिंग एजेंटों की आवश्यकताओं के साथ), और कम सीधे मात्रात्मक हैं। हालांकि, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। दवा स्क्रीनिंग को संभालते समय, समय बिंदुओं, दवा एकाग्रता, और TOP1 राशि / DNA सब्सट्रेट के अनुपात को CPT के लिए अनुकूलित वर्णित सेटिंग्स की तुलना में अनुकूलित किया जाना चाहिए। दवा की जांच डीएनए सब्सट्रेट के साथ प्रीइन्क्यूबेशन या TOP1 एंजाइम के साथ प्रीइन्क्यूबेशन करते हुए की जा सकती है। यह टीओपी 1 को रोकने के लिए अणु की क्षमता के बारे में मूल्यवान जानकारी दे सकता है और कार्रवाई के दवा तंत्र की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
इसके अलावा, यदि कम या अनुपस्थित संकेतों का अनुभव हो रहा है, तो यह कच्चे नमूने के अक्षम लाइसिस या प्रोटीज अवरोधकों के अनुचित उपयोग के कारण अर्क में टीओपी 1 के क्षरण के कारण सबसे अधिक संभावना है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण परख घटकों के अपर्याप्त भंडारण के कारण भी हो सकता है, जैसे कि पुनः संयोजक टीओपी 1, फी 29 पोलीमरेज़, न्यूक्लियोटाइड, सब्सट्रेट और प्राइमर। अंत में, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह नाटकीय रूप से परख प्रदर्शन को प्रभावित करता है। जब कच्चे अर्क का उपयोग किया जाता है, तो विशिष्ट जैविक नमूने की निष्कर्षण दक्षता को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है और टीओपी 1 की मात्रा और गतिविधि यहां बताए गए उदाहरण से भिन्न हो सकती है। इस कारण से, परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक कच्चे अर्क को उस विशेष नमूने का उपयोग करते समय परख का पता लगाने की सीमा और संवेदनशीलता की सीमा की पहचान के लिए अनुमापन की आवश्यकता होगी। प्रोटोकॉल को मानव TOP1 का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य यूकेरियोटिक टीओपी 1 की गतिविधि को मापा जा सकता है, लेकिन एनएसीएल एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय को एंजाइम शुद्धिकरण विधि और इष्टतम एंजाइम गतिविधि के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। अधिक गोलाकार सब्सट्रेट लंबे समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप होंगे, जबकि कम गोलाकार सब्सट्रेट्स छोटे इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप होंगे।
प्रस्तुत अनुप्रयोगों के अलावा, आरईईएडी कैंसर रोगियों18 से छोटी बायोप्सी से कच्चे अर्क में टीओपी 1 गतिविधि के माप के लिए अनुमति देता है, कैंसर सेल लाइनों20,21,22 में सीपीटी के साइटोटोक्सिक एंटीकैंसर प्रभाव की भविष्यवाणी, और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में एंजाइम गतिविधि का पता लगानेके लिए 20,21 . इसके अलावा, वेलमेकर का उपयोग करके प्रस्तुत आरईईएडी सेटिंग सिंथेटिक या प्राकृतिक यौगिकों के पुस्तकालयों की बहु-आधारित दवा स्क्रीनिंग को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, आरईईएडी परख का एक संशोधित संस्करण, जिसे आरईईएडी सी / एल कहा जाता है, विकसित किया गया है। यह सेटअप टॉप 1 प्रतिक्रिया27 के दरार और बंधाव चरणों की अलग-अलग जांच को सक्षम बनाता है। आरईईएडी सी / एल के साथ, छोटे अणु अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र को निर्धारित करना संभव है और उन्हें संभावित एंटीपैरासिटिक प्रभाव 28 या एंटीकैंसर उपचार24,25 के लिए उपयोग किए जाने वाले टीओपी 1 जहर के रूप में टीओपी 1 उत्प्रेरकअवरोधकों के रूप में चिह्नित करना संभव है। अंत में, अन्य टीओपी 1 एंजाइमों की विभिन्न आवश्यकताओं (डीएनए बाइंडिंग या क्लीवेज-लिगेशन के लिए) से मेल खाने के लिए डीएनए सब्सट्रेट्स के विशिष्ट रीडिज़ाइन के साथ, आरईईएडी का उपयोग संक्रामक रोगों (जैसे कि प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम के मामले में, मलेरिया29 का कारण बनता है), या लीशमैनिया डोनोवानी और मंकीपॉक्स वायरस (डेटा नहीं दिखाया गया है) का पता लगाने के लिए भी किया गया है। या, इसका उपयोग एंटीपैथोजेनिक प्रभाव वाले छोटे अणु यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल टीओपी 1 क्षेत्र में वैज्ञानिकों को एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, जिसमें कोई अनुकूलन नहीं होता है और भविष्य में और भी व्यापक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित होने की संभावना होती है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक फी 29 और टीओपी 1 एंजाइम शुद्धिकरण के संबंध में तकनीकी सहायता के लिए प्रयोगशाला तकनीशियन नोरिको वाई हैनसेन, आणविक जीवविज्ञान और आनुवंशिकी विभाग, आरहस विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |