שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד
Summary
כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) שמקורן ברקמה יכולות לשקף את המצב התפקודי של תאי המקור ואת מאפייני החלל הבין-תאי של הרקמה. העשרה יעילה של כלי רכב חשמליים אלה היא תנאי מוקדם חשוב לחקר תפקודם הביולוגי ומפתח לפיתוח טכניקות זיהוי קליניות וטכנולוגיית נשאות טיפולית. קשה לבודד sEV מרקמה מכיוון שהם בדרך כלל מזוהמים מאוד. מחקר זה מספק שיטה להעשרה מהירה של sEV באיכות גבוהה מרקמת סרטן הכבד. השיטה כוללת תהליך בן ארבעה שלבים: דגירה של אנזימי עיכול (collagenase D ו-DNase Ι) עם רקמות, סינון דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. בשל אופטימיזציה של שלב אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית והוספת שלב סינון, טוהר ה- sEV המתקבל בשיטה זו גבוה מזה שהושג על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית קלאסית. הוא מספק מתודולוגיה חשובה ונתונים תומכים לחקר sEV נגזר רקמות.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן בקוטר של כ-30 ננומטר עד 150 ננומטר והן מופרשות על ידי תאים שונים1. הם יכולים לתקשר עם תאי רקמה ולווסת את המיקרו-סביבה המקומית או הרחוקה על ידי העברת מולקולות ביולוגיות חשובות כגון שומנים, חלבונים, דנ”א ורנ”א לאיברים, רקמות, תאים וחלקים תוך-תאיים שונים. לכן, הם יכולים גם לשנות את ההתנהגות של תאים נמענים 2,3. בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים ספציפיים הוא תנאי מוקדם חיוני לחקר ההתנהגות הביולוגית שלהם במהלך התפתחות המחלה ובמהלכה. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית – הנחשבת לתקן הזהב – משמשת בדרך כלל להפרדת כלי רכב חשמליים מהרקמות שבהן הם שוכנים בדרך כלל4. פסולת רקמות, פסולת תאים, שלפוחיות גדולות וגופים אפופטוטיים ניתנים להסרה באמצעות טכניקה זו, ומשאירים רק את ה- sEVs.
הודגם כי Collagenase D ו-DNase I אינם משפיעים על המאפיינים המולקולריים של תאים או שלפוחיות, כאשר התכונות של שני האנזימים תורמות לשחרור שלפוחיות במטריצה החוץ תאית 5. אנזימים אלה שימשו למיצוי sEV מרקמת מלנומה גרורתית אנושית, רקמת סרטן המעי הגס ורקמת רירית המעי הגס 5,6,7. עם זאת, הריכוז וזמן העיכול של collagenase D ו- DNase I בשיטות אלה שונים, מה שמוביל למסקנות לא עקביות. כדי למנוע משקעים משותפים של תת-סוגים אחרים של sEVs, חוקרים הסירו בועיות חוץ-תאיות גדולות יותר (0.1 מיקרומטר או 0.2 מיקרומטר קוטר) על ידי סינון ו / או צנטריפוגה דיפרנציאלית8. בהתאם לרקמת המקור, שיטות שונות של בידוד וטיהור עשויות להידרש 9,10.
שימוש בשיטת האולטרה-צנטריפוגה הדיפרנציאלית המסורתית כדי לחלץ sEV מרקמת הכבד יוצר שכבה של חומר לבן על פני השטח של הסופרנטנט, ללא כל דרך לקבוע את תכונותיו. במחקר קודם11, שכבה זו של חומר לבן נמצאה כמשפיעה על טוהר ה-sEVs. למרות שמספר החלקיקים וריכוז החלבונים של הדגימות שבודדו בשיטה המסורתית היו גבוהים מאלה של השיטה הנוכחית, מקדם השונות היה גדול, אולי משום שמזהמים רבים יכולים להוביל לחזרתיות לקויה של התוצאות. כלומר, באמצעות חומר ניקוי (כלומר, זיהוי מסיסות של חלקיקים ב-1% טריטון X-100), מצאנו כי טוהר ה-sEV המתקבל בשיטה זו היה גדול יותר. לפיכך, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לבודד ולטהר sEV שמקורם ברקמת סרטן המעי הגס לצורך מחקר פרוטאומי.
כיום, המחקר על sEVs בסרטן הכבד מתמקד בעיקר בסרום, פלזמה, ואת supernatant של תרבית התא12,13,14. עם זאת, sEVs שמקורם ברקמת סרטן הכבד יכולים לשקף בצורה מדויקת יותר את הפתולוגיה הפיזיולוגית ואת המיקרו-סביבה הסובבת את סרטן הכבד ולמנוע ביעילות את הפירוק והזיהום של כלי רכב חשמליים אחרים15,16. עם השימוש אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, שיטה זו יכולה להעשיר את התשואה ולקבל sEV באיכות גבוהה, מתן בסיס חשוב למחקר נוסף של סרטן הכבד. שיטה זו מאפשרת לרקמת סרטן הכבד להיות מופרדת על ידי הפרדה חדה ולהיות מנותקת על ידי collagenase D ו- DNase I. לאחר מכן, פסולת התא, שלפוחיות גדולות, גופים אפופטוטיים מוסרים עוד יותר על ידי סינון אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית. לבסוף, הרכבים החשמליים מבודדים ומטוהרים למחקרים מאוחרים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה חוזרת לחילוץ sEV מרקמת סרטן הכבד. sEV באיכות גבוהה מתקבלים על ידי בידוד רקמות חד, טיפול באנזימי עיכול, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, וסינון וטיהור קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. עבור ניתוח במורד הזרם, חשוב מאוד להבטיח את הטוהר הגבוה של sEVs. בתהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית, שכבה של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן על תמיכתו בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
