Velocità di eritrosedimentazione: una caratterizzazione guidata dalla fisica in un contesto medico

Summary

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è un parametro fisico, spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Recentemente è stato sviluppato un modello teorico che consente di estrarre parametri fisicamente significativi dall’intera curva di sedimentazione, basato sulle moderne conoscenze colloidali. Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere automaticamente la VES nel tempo ed estrarre i parametri di questo modello recente da questa raccolta automatica dei dati. Questi parametri raffinati sono anche suscettibili di migliorare la testimonianza medica.

Abstract

La velocità di sedimentazione degli eritrociti (o globuli rossi) (ESR) è un parametro fisico derivato del sangue che viene spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Ad esempio, nel caso dell’infiammazione, si osserva una VES più elevata a causa dell’aumento associato del fibrinogeno e di altre proteine plasmatiche. Si riteneva che questo aumento fosse dovuto alla formazione di aggregati più grandi di globuli rossi (RBC) causati dall’aumento del fibrinogeno. In effetti, il fibrinogeno è un’aggregazione di globuli rossi che favorisce l’agente e nel regime di Stokes si presume che venga osservato nei sedimenti di aggregati più grandi del sangue più velocemente. Tuttavia, tutti i modelli di misurazione ESR basati su questa ipotesi richiedono ulteriori assunzioni fisiche specifiche, non richieste in nessun altro sistema. Inoltre, studi moderni nel campo delle sospensioni colloidali hanno stabilito che particelle attrattive formano aggregati percolanti (cioè aggregati larghi quanto il contenitore). La sedimentazione di questi colloidi segue poi un cosiddetto “collasso del gel colloidale”. Recentemente, è stato dimostrato che i globuli rossi seguono effettivamente lo stesso comportamento. Questa ipotesi permette anche di modellare in modo efficiente e analitico la curva di sedimentazione dei globuli rossi, da cui possono essere estratti descrittori robusti e fisicamente significativi. Questo manoscritto descrive come eseguire tale analisi e discute i vantaggi di questo approccio.

Introduction

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è uno strumento clinico medico in vitro, formalmente introdotto nella medicina basata sull’evidenza nel corso del XX secolo 1,2,3,4. Attualmente è utilizzato in tutto il mondo come test infiammatorio aspecifico, o per monitorare l’evoluzione di alcune condizioni specifiche 5,6,7,8. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della concentrazione di fibrinogeno, ma anche in altri componenti plasmatici come IgM 1,9,10,11. Secondo l’attuale protocollo standard Westergren, i valori ESR sono riportati come la misurazione dello strato di plasma privo di cellule in un dato punto temporale (30 minuti o 1 ora) dopo aver lasciato un tubo verticale di una dimensione tipica di 20 cm verticalmente a riposo¹². Tuttavia, questo metodo di misurazione è stato criticato poiché sono stati riportati stadi qualitativamente diversi nel processo di sedimentazione, incluso un ritardo prima di raggiungere la velocità massima di sedimentazione¹³. Questo ritardo dura più di 1 ora in circa la metà dei campioni sani¹⁴. La velocità durante questa fase obbedisce a una scala diversa rispetto alla seconda fase, più veloce della sedimentazione¹⁵. Limitare la lettura alla velocità media di assestamento durante la prima ora, quindi confrontare un diverso mix di varie proprietà del sangue tra individui diversi.

Inoltre, è stato recentemente dimostrato che le solite considerazioni teoriche alla base di questo protocollo erano errate^16,17,18. All’ematocrito fisiologico (superiore a circa il 25%), i globuli rossi (RBC) non sedimentano come aggregati separati, ma piuttosto come una rete continua, cosiddetta percolante, di globuli rossi 17,18, obbedendo a un diverso insieme di equazioni fisiche rispetto alla sedimentazione di Stokes ^16,17 solitamente menzionata. È stato dimostrato che considerare una descrizione fisica basata sulle misure risolte nel tempo della sedimentazione (intera curva) era più robusto in alcuni nuovi contesti medici^19,20. Inoltre, queste misurazioni potrebbero essere utilizzate per far luce sui meccanismi fisici che alterano la VES in patologie in cui le forme cellulari sono alterate^19,20. Inoltre, una VES lenta può avere un’utile interpretazione medica, come indicato nelle misurazioni di una coorte di pazienti con sindrome da neuroacantocitosi^19,20. Questo articolo esamina come implementare praticamente la misurazione di parametri fisicamente significativi, in base all’intera cinetica ESR. Più precisamente, il metodo qui presentato estrae la velocità massima di sedimentazione U_m, il cui valore può essere corretto per considerare l’effetto dell’ematocrito del donatore^16,17. Questo parametro è più preciso e quindi più affidabile della misura tradizionale^16,17,19,20.

Inoltre, in alcune ricerche fondamentali, invece di monitorare lo stato infiammatorio di un determinato paziente, è interessante escludere l’effetto dell’ematocrito sulla VES 21,22,23, o indagare il ruolo dei globuli rossi in una VES modificata 19,20,24,25 tra diversi donatori. Potrebbe essere utile confrontare campioni che non sono direttamente campioni di sangue completi di pazienti. Pertanto, la sospensione dei globuli rossi con un ematocrito controllato nel plasma autologo, o in un sostituente del plasma, potrebbe essere utilizzata come primo passo della misurazione della VES. Ad esempio, soluzioni di destrano 70 kDa con una concentrazione di 55 mg/ml in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) producono un intervallo di sedimentazione all’interno dell’intervallo di controllo per le cellule sane¹⁹. Questo manoscritto mostra anche come tali passi dovrebbero essere condotti, e che l’analisi presentata è rilevante anche in questi casi.

Protocol

La raccolta di campioni di sangue e gli esperimenti sono stati approvati dalla “Ärztekammer des Saarlandes”, ethics votum 51/18, ed eseguiti dopo aver ottenuto il consenso informato secondo la Dichiarazione di Helsinki. Le misurazioni standard devono essere eseguite con sangue anticoagulato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione standard di EDTA di 1,6 mg/ml di sangue, norma europea NF EN ISO 6710), in provette di Westergren. Il volume richiesto per riempire il tubo Westergren dipende dal produttore…

Representative Results

Un esempio di sequenza di immagini correttamente acquisita è fornito come filmato supplementare 1 (MovieS1.avi). Una serie di adattamenti caratteristici del modello è mostrata per varie condizioni nella Figura 2. La concentrazione di fibrinogeno è stata determinata dalla concentrazione di fibrinogeno nel plasma Fib0, supponendo che il siero non abbia alcun fibrinogeno. Quindi, Fib = C Fib0, dove C è la frazione di volume p…

Discussion

Affinché il protocollo automatizzato funzioni in modo efficiente, è importante avere uno sfondo chiaro e un’illuminazione adeguata. Uno sfondo scuro potrebbe impedire l’esistenza di una soglia di binarizzazione efficiente. Per i campioni con una certa emolisi, che di solito si verifica (aumenta) nel tempo, è importante verificare prima che la soglia di binarizzazione scelta sia rilevante sia per le immagini iniziali che per quelle finali.

Quando si tratta del processo di binarizzazione dell…

Materials

Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 – Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.