3次元細胞外マトリックスでのIDG-SW3細胞培養

サマリー

ここでは、IDG-SW3細胞を3次元(3D)細胞外マトリックスで培養するためのプロトコルを紹介します。

要約

骨細胞は、骨芽細胞から末端分化している非増殖性細胞であると考えられています。骨細胞外マトリックス(骨骨)に埋め込まれた骨芽細胞は、 Pdpn 遺伝子を発現して細胞樹状突起を形成し、骨前細胞に変化します。その後、骨前細胞は Dmp1 遺伝子を発現してマトリックスの石灰化を促進し、それによって成熟した骨細胞に変化します。このプロセスは骨細胞形成と呼ばれます。IDG-SW3は、骨細胞形成の in vitro 研究でよく知られている細胞株です。以前の多くの方法では、コラーゲンIを培養マトリックスの主成分または唯一の成分として使用していました。しかし、オステオイドには、コラーゲンIに加えて、細胞の成長、接着、移動を促進する重要な成分である粉砕物質も含まれています。さらに、マトリックス物質は透明であるため、I型コラーゲンゲルの透明性が高まり、イメージング技術による樹状突起形成の探索に役立ちます。したがって、この論文では、IDG-SW3の生存のためにコラーゲンIとともに細胞外マトリックスを使用して3Dゲルを確立するためのプロトコルを詳述します。この研究では、骨細胞形成中の樹状突起の形成と遺伝子発現を分析しました。7日間の骨形成培養後、蛍光共焦点顕微鏡下で広範囲の樹状突起ネットワークが明瞭に観察されました。リアルタイムPCRでは、 Pdpn と Dmp1 のmRNAレベルが3週間連続的に上昇していることが示されました。4週目に、実体顕微鏡で鉱物粒子を充填した不透明なゲルが発見され、蛍光X線(XRF)アッセイと一致しました。これらの結果は、この培養マトリックスが骨芽細胞から成熟骨細胞への移行をうまく促進することを示しています。

概要

骨細胞は、骨芽細胞に由来する末端分化細胞^である1,2。骨芽細胞は、骨骨に埋もれると骨細胞形成を行い、骨前細胞を形成するPdpn遺伝子、骨を^{石灰化する}Dmp1遺伝子、骨組織において成熟骨細胞として機能するSost遺伝子とFgf23遺伝子を発現^する3。ここでは、骨細胞形成プロセスにおける樹状突起の伸長とマーカー遺伝子発現を同定するために、3D培養システムを導入します。

IDG-SW3細胞は、トランスジェニックマウスに由来する不死化初代細胞株であり、異なる培地で培養すると、骨芽細胞を増殖または複製して骨細胞分化を遅らせることができます⁴。MLO-A5、MLO-Y4、および他の細胞株と比較して、IDG-SW3細胞における機能性タンパク質の発現プロファイル、カルシウム塩沈着を行う能力、および各種ホルモンに対する応答は、骨組織における初代骨細胞のそれと同じである可能性が高い⁴。

2Dシステムと比較して、3D培養システムは、栄養素の勾配、低い機械的剛性、周囲の機械的範囲など、i....

プロトコル

このプロトコルは、24ウェルプレートの4ウェルで細胞を培養するのに適しています。複数のサンプルまたはプレートを調製する場合は、それに応じて試薬の量を増やす必要があります。

1.コラーゲンI混合物の調製

注:コラーゲンIと基底膜マトリックスは室温で迅速にゲル化します。したがって、コラーゲンは氷上(2°C〜8°C)で取り扱う必要があります。使用するすべてのチップとチューブは、特に明記されていない限り、予冷する必要があります。すべての手順は安全フードで実行する必要があります。

1. すべての試薬と遠心分離管を氷の上に置きます。
2. 0.48 mL のコラーゲン I (5 mg/mL) と 0.1 mL の 10 倍ミニマム必須培地 (MEM) (フェノールレッドを含む) を、氷上に保管した滅菌済みの 15 mL 遠心チューブにゆっくりとピペットで移します。ピペッティングで静かに上下させてよく混ぜます。
3. フェノールレッドインジケーターのカラーパレットに従って、適切な容量の7.5%(w / v)NaHCO₃ (約0.2 mL)を使用して、フェノールレッドインジケーターをオレンジに調整し、pH値が7.0〜7.4の範囲にあることを示します。
   注:培地のpHに応じて、pHを約7.0〜7.4にするためにNaHCO₃

結果

生細胞/死細胞染色後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞を可視化した。すべての細胞がカルセインAM陽性(緑色)であり、圃場にはEthD-1陽性細胞(赤色)がほとんど存在せず、この方法で作製されたゲル系が骨細胞形成に非常に適していることが示されました(図1A、左)。細胞の空間分布をより適切に決定するために、ゲルのさまざまな深さで細胞樹状突起を表示するために疑似カラー画像を選択しました。赤はゲルの底部の樹状突起を示し、青は上部の樹状突起を示します。その結果、IDG-SW3細胞はこの細胞ゲルマトリックスで良好に増殖し、細胞樹状突起は7日目に骨形成培地中のネットワークに徐々に拡張したことが示されました(図1A、右、および図1B)。

実体顕微鏡下では、ゲルマトリックスの透明度は低下し続け、無細胞ゲルマトリックスとは異なり、35日目に不透明になりました(

ディスカッション

このプロトコルの重要な点は、自然凝固を防ぐために、ステップ1とステップ2を氷上で実行する必要があることです。この方法では、コラーゲンIの最終濃度は1.2mg/mLであった。したがって、最適な_ddH2O体積は、さまざまなメーカーのさまざまなコラーゲンと一致するように計算する必要があります。

生体内では、骨細胞形成は、骨芽細胞の表面から海綿骨の内部への極性移動を伴う¹⁴。このプロトコルは方向極性なしでマトリックスの成長からセルを解放する。もちろん、IDG-SW3細胞を無細胞ゲルマトリックス表面に播種することはオプションです。但し、このプロトコルで提供されるコラーゲンの集中はosteoblastの浸潤のための理論的に平らな表面を形作るには十分ではない。この目的のために、コラーゲンIと細胞外マトリックスの異なる比率をテストする必要があります。

骨骨のそれと比較すると、このゲルの剛性は十分とはほど遠いです。いくつかの論文では、in vivo<.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸	Hyclone	SH30042.01
15 mL チューブ	米国 コーニング、ニューヨーク州、米国	430791
7.5% (w/v) 重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich、MO、米国	S8761
アスコルビン酸	Sigma-Aldrich、MO、米国	A4544
コラーゲン I	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A10483-01
ウシ胎児血清	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng バイオテクノロジー、上海、中国	SKSI
レーザー共焦点蛍光顕微鏡	Carl ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ	LSM 800
ライブ/デッドセルイメージングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R37601
マトリゲル基底膜マトリックス	コーニング、ニューヨーク、米国	356234
MEM (10X)、グルタミンなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21430079
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州、米国	158127
リン酸緩衝生理食塩水	ハイクロン	SH30256。
実体顕微鏡	カール ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ	ツァイス アクシオ ZOOM。V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422

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