Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Abstract

Células-tronco pluripotentes podem gerar organoides teciduais complexos que são úteis para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas. Este protocolo descreve um método mais simples, robusto e gradual de geração de organoides da retina em um sistema híbrido de cultura consistindo de culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campo ocular (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neurorretinianas em forma de rosca, circulares e translúcidas dentro de cada EFP são manualmente colhidas e cultivadas sob suspensão usando placas de cultura não aderentes em um meio de diferenciação retiniana por 1-2 semanas para gerar copos ópticos 3D multicamadas (OC-1M). Estes organoides imaturos da retina contêm precursores multipotentes da retina com proliferação de PAX6⁺ e ChX10⁺. As células precursoras são linearmente auto-organizadas dentro dos organoides e aparecem como estrias radiais distintas. Após 4 semanas da cultura de suspensão, os progenitores da retina sofrem parada pós-mitótica e diferenciação de linhagens para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Os precursores comprometidos da linhagem fotorreceptora desenvolvem-se dentro das camadas mais externas dos organoides da retina. Essas células fotorreceptoras CRX+ e RCVRN⁺ amadurecem morfologicamente para exibir extensões segmentares internas. Este método pode ser adotado para a geração de organoides da retina usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Todas as etapas e procedimentos são claramente explicados e demonstrados para garantir a replicabilidade e para aplicações mais amplas em ciência básica e pesquisa translacional.

Introduction

A retina é um tecido sensível à luz presente na parte de trás do olho do vertebrado que converte sinais luminosos em impulsos nervosos por um fenômeno bioquímico conhecido como via de fototransdução. Os impulsos nervosos iniciais gerados nas células fotorreceptoras da retina são transduzidos para outros interneurônios da retina e células ganglionares da retina (RGCs) e atingem o córtex visual do cérebro, o que ajuda na percepção da imagem e na resposta visual.

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 1,5 milhão de crianças sejam cegas, das quais 1 milhão estão na Ásia. A distrofia hereditária da retina (DIR) é uma i....

Protocol

Todos os experimentos envolvendo hiPSCs foram realizados de forma asséptica, em aderência às práticas laboratoriais padrão, diretrizes éticas e de biossegurança, e com as aprovações de órgãos reguladores como o Comitê de Ética Institucional (IEC), Comitê Institucional de Pesquisa com Células-Tronco (IC-SCR) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBSC).

1. Preparo de cultura iPSC e meio de diferenciação retiniana e reagentes

1. Cultura iPSC e meio de manutenção
   1. Cultivar e manter a linha hiPSC normal²³ (hiPSC-F2-3F1) e uma linha CRISPR editada, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, com deleção ....

Results

A diferenciação das hiPSCs em linhagens oculares é obtida pela cultura das células em diferentes coquetéis de meio de cultura contendo suplementos e fatores de crescimento em etapas sequenciais em diferentes momentos, conforme descrito na Figura 1. As culturas de hiPSC são mantidas em meio Essential 8, o meio de manutenção de células-tronco pluripotentes. Uma vez que atinjam 70%-80% de confluência (Figura 2A), o meio é substituído por Meio de Indução de Diferenc.......

Discussion

hiPSCs são uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos in vitro. Recapitular o fenótipo da doença diferenciando hiPSCs saudáveis versus doença-específicas em direção à linhagem retiniana pode ajudar a obter novos conhecimentos sobre a fisiopatologia de diferentes formas de distrofias hereditárias da retina. Vários protocolos têm sido descritos e adotados para a diferenciação in vitro de CTPs em tipos celulares da retina. A maioria deles envolve o uso de meio de cultura con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 µ m Filtros de seringa	TPP	99722
Tubo de centrífuga de 15 mL	TPP	91015
Tubo de centrífuga de 50 mL	TPP	91050
Placas de 6 poços	TPP	92006
Anticorpo anti-Chx10; Anticorpo monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 de camundongo
anti-CRX de diluição; Abcam monoclonal de coelho	ab140603	diluição 1:300
Anticorpo anti-MiTF, Abcam monoclonal de camundongo	ab3201	diluição 1:250
Anticorpo anti-recoverina; Coelho policlonal	Millipore	AB5585	diluição 1:300
B-27 Suplemento (50x), sem soro	Thermo Fisher	17504044
Basic Fator de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Centrífuga Sigma Aldrich	F0291
5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified	Matrix Corning
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX (meio basal)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polimerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco' s Kit de Fosfato Tampolado Salino	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Placa de	Aldrich E5134
Falcon, 60 mm	Corning	351007
Fetal  Bovinos  Sérum, qualificado, Estados Unidos	Gibco	26140079
GelDocXR+ com software de laboratório de imagem	Sistema de documentação de gel de	agarose BIO-RAD
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
IgG anti-rato de cabra (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	diluição 1:300
(H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	diluição 1:300
(H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	diluição 1:300
(H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	diluição 1:300
HistoCore MULTICUT	Leica		Para seccionamento
KnockOut Substituição de Soro	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 suplemento (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		Para quantificar RNA
Paraformaldeído	Qualigens	23995
Pipetas Pasteur, 9 polegadas, Não Estéril, Desconectadas	Corning	7095D-9
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher	15140-122
recombinante monoclonal do	de Abcam	ab183951	:300
; Abcam monoclonal de coelho		ab195045	diluição 1:300
anticorpo anti-RPE65 recombinante, Abcam monoclonal de coelho		ab231782	diluição 1:300
de cabeça humana recombinante R	& D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Pipetas sorológicas 10 mL	TPP	94010
Pipetas sorológicas 5 mL	TPP	94005
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S7653
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost ( revestido com silano) lâminas microscópicas	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol  Reagente	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Montagem Média com DAPI	Laboratórios de vetores	H-1200
Vitronectina	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dicloridrato (inibidor da Rho-quinase)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Microscópio confocal	Zeiss