Kirurgisk teknikk for overlegen cervikal ganglionektomi i en murinmodell
Summary
Den foreliggende protokollen beskriver en musemodell av ablasjon av adrenerg innervering ved å identifisere og resektere den overlegne cervikale ganglion.
Abstract
Økende bevis tyder på at det sympatiske nervesystemet spiller en viktig rolle i kreftprogresjon. Adrenerg innervering regulerer spyttkjertel sekresjon, sirkadisk rytme, makuladegenerasjon, immunfunksjon og hjertefysiologi. Murine kirurgisk sympatektomi er en metode for å studere effekten av adrenerg innervering ved å muliggjøre fullstendig, ensidig adrenerg ablasjon samtidig som man unngår behovet for gjentatt farmakologisk intervensjon og tilhørende bivirkninger. Imidlertid er kirurgisk sympatektomi hos mus teknisk utfordrende på grunn av den lille størrelsen på den overlegne cervikale ganglion. Denne studien beskriver en kirurgisk teknikk for pålitelig identifisering og resecting av overlegen cervikal ganglion for å ablate det sympatiske nervesystemet. Den vellykkede identifiseringen og fjerningen av ganglion valideres ved å avbilde de fluorescerende sympatiske gangliene ved hjelp av en transgen mus, identifisere postreseksjon Horners syndrom, farging for adrenerge markører i resekterte ganglier og observere redusert adrenerg immunfluorescens i målorganene etter sympatektomi. Denne modellen muliggjør fremtidige studier av kreftprogresjon samt andre fysiologiske prosesser regulert av det sympatiske nervesystemet.
Introduction
Flere studier har rapportert at nerver i tumormikromiljøet spiller en aktiv rolle i å støtte tumorprogresjon. Ablasjon av adrenerge sympatiske nerver har vist seg å svekke tumorutvikling og spredning i prostata- og magekreft in vivo 1,2,3, mens den farmakologiske blokaden av adrenerge reseptorer hemmer tumorvekst i hode- og nakkekreft4. Sympatisk nevral involvering er også beskrevet i progresjon av bukspyttkjertel, cervikalt og basalcellekarsinom 5,6,7.
Innenfor det sympatiske nervesystemet er overlegen cervikal ganglion (SCG) den eneste ganglion av den sympatiske stammen som innerverer hodet. SCG regulerer ulike fysiologiske funksjoner, som spyttsekresjon og døgnrytme, og innerverer direkte livmorhalsk lymfeknuter 8,9,10. SCG har også vært involvert i patologiske prosesser som makuladegenerasjon11 og progresjonen av aortadisseksjon12. I tillegg har reseksjon av SCG blitt rapportert å forverre iskemi reperfusjonsindusert akutt nyreskade13 og også endre tarmmikrobiota hos rotter14.
Den komplette ablasjonen av SCG i en musemodell vil representere en verdifull eksperimentell teknikk for å muliggjøre kreft og autonom nervesystemforskning. Mens mange studier har benyttet farmakologisk adrenerg reseptorblokade som en adrenerg ablasjon 15,16,17,18,19,20, tillater kirurgisk reseksjon fullstendig, ensidig adrenerg ablasjon samtidig som man unngår behovet for gjentatt farmakologisk intervensjon og tilhørende bivirkninger 21,22,23.
Kirurgisk reseksjon av SCG er beskrevet hos rotter24, og de fleste rapporter som studerer effekten av overlegen cervikal ganglionektomi (SCGx) har benyttet rottemodellen. Sammenlignet med rottemodellen er SCGx teknisk mer utfordrende hos mus på grunn av den lille størrelsen på SCG. Imidlertid er mus relativt lettere å håndtere, mer kostnadseffektive og mer mottagelige for genetisk manipulasjon. Garcia et al. var en av de første som rapporterte SCGx hos mus, og det ble funnet å påvirke insulinfrigivelse25. Mer nylig beskrev Ziegler et al. SCGx hos mus basert på den publiserte teknikken beskrevet for rotter24,26. Denne og andre artikler beskriver en metode der arteria carotis communis (CCA) først identifiseres og dissekeres, og SCG deretter fjernes fra bifurkasjonen av CCA21,22,27,28. I denne artikkelen er en mindre invasiv og sikrere teknikk beskrevet hos mus som unngår disseksjon av CCA, og dermed minimerer den mest alvorlige komplikasjonen av denne prosedyren – blødning fra en skade på CCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en musemodell for kirurgisk ensidig ablasjon av SCG-inngang. Denne teknikken gjør det mulig å studere effekten av adrenerg innervering i ulike innstillinger. I tillegg kan det resekterte sympatiske ganglion også dyrkes i 3D matrigel kultur for in vitro eksperimenter30.
Studier som involverer SCGx har for det meste blitt utført på rotter, da deres større anatomi muliggjør enklere anatomisk visualisering og disseksjon. Mens SCGx…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Q. W. ble støttet av NIH T32CA009685. R. J. W. ble støttet av NIH R01CA219534. Memorial Sloan Kettering Cancer Center Core Facilities ble støttet av NIH P30CA008748.
Materials
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115 (2014).
- Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
- Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
- Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
- Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
- Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
- Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
- Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
- Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
- Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
- Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
- Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
- Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
- Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
- Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
- Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
- Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
- Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
- Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
- Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
- Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
- Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
- Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
- Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
- Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
- Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
- Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
- Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).
