אקס ויוו ניתוח של Ca2+ transients מופעל מכנית בתאי השתן
Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להערכת תפקודן של תעלות יונים המופעלות מכנית בתאי שתן טבעיים באמצעות חיישן Ca2+ פלואורסצנטי GCaMP5G.
Abstract
תעלות יונים המופעלות מכנית הן מתמרים ביולוגיים הממירים גירויים מכניים כגון כוחות מתיחה או גזירה לאותות חשמליים וביוכימיים. ביונקים, תעלות המופעלות באופן מכני חיוניות לאיתור גירויים חיצוניים ופנימיים בתהליכים מגוונים כמו תחושת מגע, שמיעה, ויסות נפח תאי הדם האדומים, ויסות לחץ הדם הבסיסי ותחושת מלאות בשלפוחית השתן. בעוד שתפקודן של תעלות יונים המופעלות באופן מכני נחקר בהרחבה בסביבה חוץ-גופית תוך שימוש בטכניקת מהדק הטלאים, הערכת תפקודן בסביבתן הטבעית נותרה משימה קשה, לעתים קרובות בגלל גישה מוגבלת לאתרי הביטוי של תעלות אלה (למשל, טרמינלים רגשיים, תאי מרקל, ברצפטורים וצינוריות כליות) או קשיים ביישום טכניקת מהדק הטלאים (למשל, המשטחים האפיקליים של תאי מטריה של השתן). פרוטוקול זה מתאר הליך להערכת מעברי Ca 2+ מעוררים מכנית באמצעות חיישן פלואורסצנטי GCaMP5G בהכנה אורותלית ex vivo, טכניקה שניתן להתאים בקלות לחקר אירועי Ca2+ מעוררים מכנית בתכשירים רקמתיים מקומיים אחרים.
Introduction
תאי אפיתל בדרכי השתן נתונים לכוחות מכניים כאשר סינון השתן עובר דרך הנפרונים, והשתן נשאב מאגן הכליה ועובר דרך השופכנים כדי להיאגר בשלפוחית השתן. זה זמן רב ידוע כי כוחות מכניים (למשל, לחץ גזירה ומתיחה) המופעלים על ידי נוזלים על תאי אפיתל המרפדים את דרכי השתן מווסתים את הספיגה מחדש של חלבון בצינורית הפרוקסימלית ושל מומסים בנפרון הדיסטלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, וכן אחסון שתן בשלפוחית השתן והשתן14,15,16,17.
ההמרה של גירויים מכניים לאותות חשמליים וביוכימיים, תהליך המכונה מכנוטרנסדוקציה, מתווכת על ידי חלבונים המגיבים לעיוות של מבנים תאיים או מטריצה חוץ-תאיתקשורה 18,19,20,21. תעלות יונים המופעלות באופן מכני הן ייחודיות במובן זה שהן עוברות ממצב סגור למצב חדיר פתוח בתגובה לשינויים במתח הממברנה, לחץ או לחץ גזירה 18,19,20,21,22. בנוסף, Ca 2+ transients יכול להיות מופעל על ידי mechanotransduction בתיווך אינטגרין או על ידי הפעלה של מערכות הידבקות mechanoresponsive בצמתים תאתא 23,24,25,26. תפקוד תעלת היונים מוערך בדרך כלל בטכניקת מהדק טלאי, הכוללת היווצרות חותם ג’יגה-אוהם בין קרום התא לבין פיפטת התיקון27. עם זאת, תאים הממוקמים בשכבות רקמה עמוקות עם מטריצה חוץ-תאית צפופה (למשל, צינוריות כליות) או מוקפים במחסום פיזי (למשל, glycocalyx) קשה לגשת עם מיקרופיפטה זכוכית. כמו כן, תאים המשובצים או שהם חלקים אינטגרליים של רקמות עם יציבות מכנית ירודה (למשל, אורותל) לא ניתן לחקור בקלות עם טכניקת מהדק טלאי. מכיוון שתעלות יונים רבות המופעלות מכנית חדירות ל- Ca 2+, גישה חלופית היא להעריך את פעילותן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות צבע רגיש ל- Ca2+ או מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) כגון GCaMP. מאמצים אחרונים בהנדסת חלבונים הגדילו באופן משמעותי את הטווח הדינמי, הרגישות והתגובה של GECIs28,29,30, וההתקדמות בגנטיקה אפשרה את ביטוים באוכלוסיות תאים ספציפיות, מה שהופך אותם למתאימים באופן אידיאלי לחקר מכנוטרנסדוקציה.
האורוטל, האפיתל המרובד המכסה את פנים שלפוחית השתן, מתפקד כמחסום, מונע דיפוזיה של מומסים בשתן לתוך אינטרסטיציום שלפוחית השתן, אך מתפקד גם כמתמר, חש מלאות שלפוחית השתן ומתקשר אירועים אלה לעצבים ולשרירים הבסיסיים16. מחקרים קודמים הראו כי התקשורת בין השתן לבין הרקמות הבסיסיות דורשת את תעלות היונים המופעלות מכנית Piezo1 ו- Piezo231. כדי להעריך את מעברי Ca 2+ המושרים מכנית בתאי השתן, פותחה טכניקה חדשה שתוארה המשתמשת בהעברת גנים אדנו-ויראליים כדי לבטא את חיישן Ca2+ GCaMP5G בתאי השתן. טכניקה זו משתמשת בהכנת יריעה רירית המספקת גישה קלה לשכבת תאי המטריה החיצונית ביותר ומערכת בסיוע מחשב לגירוי מכני סימולטני של תאים בודדים עם מיקרופיפטה סגורה מזכוכית ורישום שינויים בפלואורסצנטיות לאורך זמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כל האורגניזמים, ולכאורה רוב סוגי התאים, מבטאים תעלות יונים המגיבות לגירויים מכניים 20,33,34,35,36,37. הפונקציה של תעלות מופעלות מכנית אלה הוערכה בעיקר עם טכניקת מהדק טלאי. עם זאת, בשל בעיו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- MDC) ו- S10OD028596 (ל- G.A.) ועל ידי ליבות הדמיית הכליות של פיזיולוגיה של התא ואורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
